單克隆抗體技術(shù)

單克隆抗體技術(shù)匯報人：陳海云吳亞榮指導(dǎo)老師：余為一主要內(nèi)容： 一、概念 二、單克隆抗體的原理 三、單克隆抗體的制備 四、單克隆抗體的應(yīng)用

1975年Kohler&Milstein創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)，獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎創(chuàng)立者：一、概念多克隆抗體（PcAb）：病原微生物和天然抗原含有多種抗原決定簇，刺激機體免疫系統(tǒng)后，可形成針對不同抗原決定簇的混合抗體。單克隆抗體（mAb)：單個淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生，針對一種特定抗原決定簇的抗體。

單抗和多抗產(chǎn)生區(qū)別小鼠多克隆抗體（PcAb）與單克隆抗休（McAb）的比較項目PcAbMcAb抗體的制備用免疫血清用雜交瘤技術(shù)抗體的濃度0.1-1.0mg/ml（血清）10-100μg/ml(培養(yǎng)上清)1-10mg/ml（血清）5-20mg/ml（腹水）均一性抗體組成復(fù)雜抗體組成單一特異性抗體批間有差異抗體批間無差異識別的抗原決定簇多單一二、基本原理三、制備流程：材料準(zhǔn)備實驗動物：

與骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系的動物（BALB/c小鼠6-8周齡20-25g）

抗原：可溶性抗原或顆粒性抗原B淋巴細(xì)胞：小鼠脾臟骨髓瘤細(xì)胞：與實驗小鼠同一品系的動物細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)。常用骨髓瘤細(xì)胞SP2/0、NS1等。材料準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其他活細(xì)胞則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的細(xì)胞稱飼養(yǎng)細(xì)胞。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟細(xì)胞、胸腺細(xì)胞。作用營養(yǎng)作用

清潔作用細(xì)胞融合方法骨髓瘤細(xì)胞B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞-B細(xì)胞B細(xì)胞-B細(xì)胞B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合篩選雜交瘤細(xì)胞方法：電融合激光融合離心融合滅活的病毒融合聚乙二醇融合法脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為3:1或5:1,最為常用。大概1-2周后，小鼠腹部會膨脹，抽取小鼠腹水，可獲得大量單克隆抗體。體內(nèi)培養(yǎng)法體外培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞碎片，可獲得單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞的篩選1雜交瘤細(xì)胞的篩選2單克隆抗體的應(yīng)用篩選原理在實際免疫過程中，一種抗原決定簇只能刺激機體形成相對應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預(yù)定抗原快定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞。第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞DNA合成途徑1.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸

2.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT酶3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）TK酶HAT選擇培養(yǎng)基的組分次黃嘌呤（hypoxanthine,H)胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)氨甲喋呤（aminopterin,A):葉酸拮抗劑，是細(xì)胞合成DNA的阻斷劑。

正常B細(xì)胞利用HAT培養(yǎng)液中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，在

次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGRPT）和胸腺嘧啶激酶

(TK)的催化下經(jīng)旁路合成DNA。

骨髓瘤細(xì)胞是遺傳基因缺陷型的細(xì)胞系，缺乏HGRPT或TK。HGRPT酶TK酶雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞生長情況融合后3~4天后，可見外形似骨髓瘤細(xì)胞，渾圓透亮的克隆。融合后第7~9天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體四、抗體的檢測篩選：免疫酶技術(shù)——間接ELISA免疫熒光技術(shù)ELISA原理將抗原包被于酶標(biāo)板，與待檢雜交瘤細(xì)胞上清液反應(yīng)，如該上清液中含有特異性的抗體（一抗Ab），即可與酶標(biāo)二抗作用，加底物經(jīng)酶催化呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，通過檢測OD值判定結(jié)果。雜交瘤細(xì)胞的克隆化目的：建立單一細(xì)胞的克隆方法：有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽性孔計數(shù)0.1ml/孔單克隆抗體的應(yīng)用醫(yī)學(xué)上用作診斷試劑1鑒別淋巴細(xì)胞2鑒別病原體，診斷傳染病3腫瘤的診斷和分型4激素類單抗用于判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)單克隆抗體的應(yīng)用用作研究工具1.純化抗原2.