自噬線粒體自噬在鋅誘導(dǎo)的抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)中的作用

自噬/線粒體自噬在鋅誘導(dǎo)的抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)中的作用目的1?觀察ZnCl₂是否通過誘導(dǎo)自噬/線粒體自噬來減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧引起的活性氧(ROS)產(chǎn)生并保護(hù)心肌細(xì)胞。2?探討ZnCl₂誘導(dǎo)自噬/線粒體自噬的分子機(jī)制。方法建立心肌細(xì)胞H9c2缺氧/復(fù)氧模型。用透射電鏡觀察線粒體的結(jié)構(gòu)和功能改變、線粒體自噬泡的形成情況；Westernblotting法檢測LC3、TOM2O、TIM23、C0X4、Beclinl、PINK1蛋白表達(dá)及ERK、mTOR、AMPK、Bcl-2磷酸化水平;qPCR檢測NIX和PINK1mRNA水平的改變;用免疫熒光法檢測GFP-LC3自噬體和TOM20的共定位、MitotrackGreen(MTG)和PINK1的共定位;用線粒體熒光探針JC-1、ROS熒光探針DCFH-DA、線粒體ROS熒光探針MitosoxRed在共聚焦顯微鏡上分別測定線粒體膜電位(Mitochondrialmembranepotential,△甲m)、細(xì)胞內(nèi)總ROS和線粒體ROS水平。結(jié)果1.共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示。與正常對照組相比，復(fù)氧時(shí)細(xì)胞和線粒體內(nèi)的ROS明顯增加。用ZnCl₂處理細(xì)胞可減少ROS水平，表明ZnCl₂可減少復(fù)氧時(shí)線粒體ROS的產(chǎn)生。2.在正常生理?xiàng)l件下,H9c2細(xì)胞經(jīng)不同濃度的ZnCl₂處理后,LC3-II水平均明顯升高,其中以5口M最為明顯。用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞48h后，用ZnCl₂處理細(xì)胞使GFP-LC3熒光明顯增強(qiáng)。另外Rapamycin(20口M)和饑餓(8h)也使LC3-1水平升高，這種作用可被選擇性ZnCl₂螯合劑TPEN所逆轉(zhuǎn)。抑制劑BafilomycinAl(BAI)可進(jìn)一步促使LC3-II水平升高，表明ZnCl₂可增加自噬流。3.免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞48h后,ZnCl₂使GFP-LC3自噬體與線粒體外膜蛋白T0M20的共定位明顯增加，表明在生理?xiàng)l件下ZnCl₂可誘導(dǎo)線粒體自噬。電鏡檢查結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的細(xì)胞，線粒體正常分布于細(xì)胞內(nèi)，用鋅離子處理細(xì)胞30min后，部分線粒體被自噬體包裹。Westernblotting分析結(jié)果顯示線粒體標(biāo)志性蛋白包括外膜蛋白T0M20、內(nèi)膜蛋白TIM23和C0X4的表達(dá)均下降，進(jìn)一步證明ZnCl₂可誘導(dǎo)線粒體自噬。4.在缺氧/復(fù)氧條件下,ZnCl₂增加GFP-LC3自噬體與線粒體外膜蛋白TOM20的共定位。電鏡結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧使線粒體斷裂，線粒體移位，空泡化增多，可見自噬體;而ZnCl₂處理組，線粒體水腫空泡化減少，自噬體，自噬溶酶體，自噬體包裹線粒體增多。另外,ZnCl₂使TOM2O、TIM23和COX4的表達(dá)均降低，使LC3-II水平明顯升高，表明復(fù)氧時(shí)ZnCl₂可促進(jìn)線粒體自噬，清除損傷的線粒體。5.在缺氧/復(fù)氧模型中，ZnCl₂處理H9c2細(xì)胞后,T0M20、TIM23和COX4蛋白水平明顯降低，而LC3-II水平則明顯升高,ZnCl₂的這些作用可被自噬抑制劑3-MA所抑制。同時(shí)，自噬抑制劑3-MA可抑制ZnCl₂對細(xì)胞ROS和線粒體ROS的影響，表明ZnCl₂通過誘導(dǎo)自噬/線粒體自噬發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激作用。ERK磷酸化，使LC3-II水平升高，促進(jìn)T0M20、TIM23和C0X4的降解。ZnCl₂的這些作用可被MEK抑制劑PD98059所抑制，表明ERK信號(hào)通路參與ZnCl₂誘導(dǎo)的自噬/線粒體自噬。在缺氧/復(fù)氧模型中，ZnCl₂使Beclinl和LC3-II水平升高，使T0M20、TIM23和C0X4表達(dá)下降,而這些作用被BeclinlsiRNA所抑制，表明Beclinl參與ZnCl₂誘導(dǎo)的自噬/線粒體自噬。另外,PD98059可抑制ZnCl₂對Beclin1表達(dá)和Bcl-2磷酸化的影響，表明在ZnCl₂誘導(dǎo)自噬的過程中，ERK位于Beclin1和Bcl-2的上游。在缺氧/復(fù)氧模型中，ZnCl₂可促進(jìn)線粒體T0M20、TIM23和COX4表達(dá)下降，而這些作用可被PINK1siRNA所抑制。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ZnCl₂使Mitotracker(MTG)與PINK1的共定位增加，而該效應(yīng)被PD98059所阻斷，表明PINK1參與ZnCl₂誘導(dǎo)的線粒體自噬過程且可能位于ERK下游。ZnCl₂減少復(fù)氧時(shí)ROS水平,而該作用被Beclin1siRNA和PINK1siRNA所抑制，表明Beclin1和PINK1均參與ZnCl₂的抗氧化應(yīng)激作用。9.ZnCl₂可減少缺氧/復(fù)氧引起的線粒體膜電位的降低，增加細(xì)胞活性。ZnCl₂的這種作用被Beclin1siRNA和PINK1siRNA所逆轉(zhuǎn)，表明Beclin1和PINK1均參與ZnCl₂抗缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。結(jié)