金免疫標(biāo)記技術(shù)

金免疫標(biāo)記技術(shù)金免疫標(biāo)記技術(shù)第1頁知識目標(biāo)技能目標(biāo)素質(zhì)目標(biāo)1.掌握金免疫標(biāo)識技術(shù)原理和分類2.了解標(biāo)識物制備3.了解金免疫檢測臨床應(yīng)用1.會金免疫標(biāo)識物制備操作2.會熟練操作金免疫檢測過程樹立嚴(yán)厲認(rèn)真、實(shí)事求是、高度負(fù)責(zé)科學(xué)態(tài)度，含有良好職業(yè)素質(zhì)和高尚職業(yè)道德。

任務(wù)目標(biāo)金免疫標(biāo)記技術(shù)第2頁任務(wù)對象肺炎支原體抗體檢測

金免疫標(biāo)記技術(shù)第3頁

任務(wù)過程

復(fù)習(xí)提問

案例導(dǎo)入

講解與示教學(xué)生操作討論分析

評價、考評

課后思索題教學(xué)環(huán)節(jié)2′30′2′10′40′5′1′金免疫標(biāo)記技術(shù)第4頁

患兒，女，11歲，間斷發(fā)燒1周，伴咳嗽3天。體溫最高39。1度，病程第2天查血常規(guī)正常，診療“呼吸道感染”并靜滴“阿奇霉素”3天，無顯著改變，即而出現(xiàn)咳嗽，為陣發(fā)性刺激性咳嗽，少痰，胸片提醒：雙肺紋理增粗，右上肺片影。復(fù)查血常規(guī)仍正常。患兒肺部感染系哪種病原體所致？怎樣快速診療？案例導(dǎo)入金免疫標(biāo)記技術(shù)第5頁

斑點(diǎn)金免疫層析法演示

肺炎支原體診療試劑盒講解與示教金免疫標(biāo)記技術(shù)第6頁

二用采血針采指尖血一洗凈雙手四馬上加1-2滴緩沖液

三將1滴指尖血滴入加樣孔操作金免疫標(biāo)記技術(shù)第7頁步驟5：15分鐘讀取結(jié)果

？？結(jié)果？？結(jié)果金免疫標(biāo)記技術(shù)第8頁老師糾正點(diǎn)評

學(xué)生操作一位學(xué)生操作演示學(xué)生分組再操作金免疫標(biāo)記技術(shù)第9頁討論分析提出問題為何在小小試紙條上出現(xiàn)兩條紅線就是陽性結(jié)果，如此簡單、方便方法可靠嗎？有假陽性或假陰性可能嗎？怎樣檢測出來，原理是什么？金免疫標(biāo)記技術(shù)第10頁膠體金標(biāo)識技術(shù)(Immunogoldlabelingtechnique)

是以膠體金作為示蹤標(biāo)識物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)一個新型免疫標(biāo)識技術(shù)。討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第11頁膠體金標(biāo)識技術(shù)討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第12頁（一）金免疫檢測原理膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小金顆粒，并因?yàn)殪o電作用成為一個穩(wěn)定膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子正電荷基團(tuán)形成牢靠結(jié)合，因?yàn)檫@種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)生物特征。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還能夠與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。依據(jù)膠體金一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物免疫和生物學(xué)特征，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第13頁Geobegan等將膠體金標(biāo)識抗體用于普通光鏡下檢測B淋巴細(xì)腦表面膜免疫球蛋白，建立了光鏡水平免疫金染色。Faulk和Taylor首創(chuàng)膠體金標(biāo)識免疫電鏡技術(shù)膠體金標(biāo)識技術(shù)深入發(fā)展應(yīng)用于免疫轉(zhuǎn)印、流式細(xì)胞術(shù)、液相免疫測定、固相斑點(diǎn)金／銀染色及斑點(diǎn)金免疫滲濾測定法等各種標(biāo)識免疫檢測方法1971年1978年多年來討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第14頁討論分析枸櫞酸三鈉還原法鞣酸—枸櫞酸鈉還原法依據(jù)不一樣還原劑能夠制備大小不一樣膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒方法金免疫標(biāo)記技術(shù)第15頁膠體金制備

1．枸櫞酸三鈉還原法（1）10nm膠體金粒制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色。（2）15nm膠體金顆粒制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min～30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混勻即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm膠體金顆粒制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。依據(jù)需要快速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這么制成膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、30nm和50nm討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第16頁2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

B液：1％枸櫞酸三鈉4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/LK2CO3液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下快速將B液加入A液中，溶液變藍(lán)，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得金顆粒直徑為5nm。如需要制備其它直徑金顆粒，則按表15-1所列數(shù)字調(diào)整鞣酸及K2CO3用量

討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第17頁（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理玻璃器皿，或用第一次配制膠體金穩(wěn)定玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。不然影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒穩(wěn)定性，不能取得預(yù)期大小金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格純凈，全部試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45μm）過濾，以除去其中聚合物和其它可能混入雜質(zhì)。制備高質(zhì)量膠體金注意事項

討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第18頁（3）配制膠體金溶液pH以中性（pH7.2）很好。（4）氯金酸質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，因?yàn)槁冉鹚嵋壮苯猓栽谂渲茣r，最好將整個小包裝一次性溶解。制備高質(zhì)量膠體金注意事項討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第19頁

缺點(diǎn)金標(biāo)法

優(yōu)點(diǎn)

靈敏度不如酶標(biāo)技術(shù)普通作為定性，不易定量。討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第20頁自帶質(zhì)控對照簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用符號顯示結(jié)果快速：全部檢測過程僅需3-20分鐘。示蹤劑：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過程后顏色標(biāo)識討論分析可單份檢測，穩(wěn)定性好金免疫標(biāo)記技術(shù)第21頁斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)夾心法競爭法雙抗原夾心法雙抗體夾心法討論分析分類金免疫標(biāo)記技術(shù)第22頁

雙抗體夾心法G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體

吸水紙標(biāo)本討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第23頁討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第24頁競爭法標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陽性結(jié)果討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第25頁標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原吸水紙陰性結(jié)果討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第26頁討論分析金免疫標(biāo)記技術(shù)第27頁

斑點(diǎn)金免疫滲濾測定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強(qiáng)墊料，即為滲濾裝置。在加抗原（抗體）后，快速加抗體（抗原），再加金標(biāo)識第二抗體，因?yàn)橛袧B濾裝置，反應(yīng)很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng)。此方法已成功地應(yīng)用于人免疫缺點(diǎn)病病毒