色瑞替尼有關(guān)物質(zhì)遺傳毒性的定量評(píng)價(jià)研究

色瑞替尼有關(guān)物質(zhì)遺傳毒性的定量評(píng)價(jià)研究

色瑞麗是第二代間變性腫瘤激酶抑制劑。這是一種臨床治療中性生物。例如，異質(zhì)甲基腫瘤激酶突變陽(yáng)性或無(wú)法忍受的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌。2014年獲得f國(guó)家發(fā)展計(jì)劃委員會(huì)批準(zhǔn)，2018年在中國(guó)上市。色瑞替尼合成路線較多，其代表性合成路線見圖1，由中間體4-(4-氨基-5-異丙氧基-2-甲基苯基)-1-哌啶羧酸叔丁酯(13)與中間體2,5-二氯-N-[2-(異丙基磺酰基)苯基]嘧啶-4-胺(4)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)得到4-[4-[[5-氯-4-[[2(異丙基磺?；?苯基]氨基]嘧啶-2-基]氨基]-5-異丙氧基-2-甲基苯基]-1-哌啶羧酸叔丁酯(14),14再在三氟乙酸的作用下脫去Boc保護(hù)基，得終產(chǎn)品色瑞替尼(1)其中起始原料2和6及中間體7和13作為工藝雜質(zhì)可能殘留在終產(chǎn)品中。雜質(zhì)2和13結(jié)構(gòu)中含有苯胺類警示結(jié)構(gòu)，雜質(zhì)6和7含有硝基苯類警示結(jié)構(gòu)，均為潛在遺傳毒性雜質(zhì)由于遺傳毒性雜質(zhì)較普通雜質(zhì)有較高的致癌風(fēng)險(xiǎn)，通常可接受限度低，對(duì)合成工藝和生產(chǎn)水平均提出了較高要求，對(duì)分析方法尤其是靈敏度也提出了很大挑戰(zhàn)。因此有必要對(duì)色瑞替尼中含警示結(jié)構(gòu)的潛在工藝雜質(zhì)展開進(jìn)一步的遺傳毒性(致突變性)評(píng)價(jià)研究，為色瑞替尼中有關(guān)物質(zhì)的分類分級(jí)控制提供指導(dǎo)和依據(jù)。1材料和方法1.1專家知識(shí)規(guī)則的毒性預(yù)測(cè)Derek版本：DerekNexus6.0.1；數(shù)據(jù)庫(kù)：DerekKB20181.1，由英國(guó)Lhasa公司(/)研制。本研究所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)日期為2017年11月23日。Derek是基于專家知識(shí)規(guī)則的毒性預(yù)測(cè)系統(tǒng)，基本設(shè)置如下：物種設(shè)為細(xì)菌(bacterium)，預(yù)測(cè)終點(diǎn)設(shè)置為遺傳毒性(genotoxicity)項(xiàng)下的致突變性(mutagenicity)。Sarah版本：SarahNexus:3.0.0；模型：SarahModel2.0，由英國(guó)Lhasa公司(/)研制。Sarah是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的化合物致突變性預(yù)測(cè)工具，與Derek為互補(bǔ)的2種(Q)SAR預(yù)測(cè)方法。Nexus版本：Nexus:2.2.1，由英國(guó)Lhasa公司(/)研發(fā)，為軟件的整合平臺(tái)。本研究采用Nexus系統(tǒng)中已經(jīng)固化的ICHM7分類模式(ICHM7batchclassification)對(duì)雜質(zhì)遺傳毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)和自動(dòng)分類。1.2ames試驗(yàn)1-氯-5-異丙氧基-2-甲基-4-硝基苯(CAS:1032903-50-6；批號(hào)：8432)、4-(5-異丙氧基-2-甲基-4-硝基-苯基)-吡啶(CAS:1032903-62-0；批號(hào)：8464)、4-(4-氨基-5-異丙氧基-2-甲基苯基)-1-哌啶羧酸叔丁酯(CAS:1032903-63-1；批號(hào)：8445)均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、WP2uvrApKM101、TA1535均購(gòu)自北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司。Ames試驗(yàn)中所使用的代謝活化系統(tǒng)S9以及敵克松、2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、疊氮化鈉和2-氨基蒽陽(yáng)性對(duì)照試劑等均來(lái)自Ames試劑盒(北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：20200710);DMSO(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190821)。1.3潛在工藝雜質(zhì)預(yù)測(cè)藥物及有關(guān)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖采用Chemdraw12.0繪制，分別為色瑞替尼及其4個(gè)具有警示結(jié)構(gòu)的潛在工藝雜質(zhì)(雜質(zhì)2,6,7,13)，輸入Nexus2.1.1，采用ICH分類模式進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見表1。1.4培養(yǎng)條件的選擇Ames試驗(yàn)依據(jù)GB/T21786-2008《化學(xué)品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法》設(shè)計(jì)，采用平板摻入法試驗(yàn)。將冷凍保存的TA97a、TA98、TA100、WP2uvrApKM101和TA1535試驗(yàn)菌株培養(yǎng)物分別接種于10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，以每分鐘100次振蕩，37℃恒溫培養(yǎng)10h。將2.0mL頂層培養(yǎng)基(含0.5mmol·L2結(jié)果2.1教師的分類lausb雜質(zhì)6,7,13的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Derek均為貌似可信(Plausible),Sarah分別為陰性(Negative)、模棱兩可(Equivocal)和陰性(Negative)，由于警示結(jié)構(gòu)不存在于色瑞替尼中，故分類為3類。結(jié)果見表1。2.2回復(fù)突變?cè)囼?yàn)在抑菌作用預(yù)試驗(yàn)中，3種雜質(zhì)在每皿5000,2500,1250μg劑量組中都顯示出一定的毒性作用，因此在正式試驗(yàn)中，選擇的濃度為每皿1800,600,200,67,22μg，其中高劑量為對(duì)細(xì)菌出現(xiàn)毒性作用的較低濃度，劑量間隔為3。結(jié)果顯示，在加與不加代謝活化系統(tǒng)的情況下，溶劑對(duì)照組各試驗(yàn)菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，不同陽(yáng)性對(duì)照組各試驗(yàn)菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)均超過(guò)溶媒對(duì)照組2倍，色瑞替尼雜質(zhì)6、雜質(zhì)7和雜質(zhì)13在每皿1800,600,200,67,22μg劑量時(shí)，對(duì)TA97a、TA98、TA100、WP2uvrApKM101和TA1535誘導(dǎo)的回復(fù)突變菌落數(shù)與溶劑對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也未呈現(xiàn)濃度依賴性增加，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，受試物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌為致突變陰性。結(jié)果見表2～4。3遺傳毒性試驗(yàn)?zāi)壳半s質(zhì)基因毒性的評(píng)估方法主要是通過(guò)文獻(xiàn)檢索或(Q)SAR等計(jì)算機(jī)評(píng)估方法本研究首先采用Sarah和Derek對(duì)色瑞替尼的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了(Q)SAR評(píng)價(jià)，所使用的Sarah是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的化合物致突變性預(yù)測(cè)工具，所使用的Derek是基于專家知識(shí)規(guī)則的毒性預(yù)測(cè)系統(tǒng)，滿足ICHM7指導(dǎo)原則中需要采用2種互補(bǔ)的、原理不同的(Q)SAR方法進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬毒性評(píng)估的要求隨后本研究采用Ames試驗(yàn)對(duì)雜質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。在抑菌作用的預(yù)試驗(yàn)中，3個(gè)雜質(zhì)在較高濃度的菌落數(shù)均低于溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，顯示出了一定的細(xì)菌毒性，因此在后續(xù)的正式試驗(yàn)中選用的高劑量為無(wú)顯著毒性作用的劑量(每皿1800μg)。結(jié)果顯示，色瑞替尼雜質(zhì)6、雜質(zhì)7和雜質(zhì)13在每皿22～1800μg內(nèi)，在S9存在或不存在的情況下，結(jié)果均為陰性。遺傳毒性除了點(diǎn)突變外，還包括染色體畸變，如染色體丟失、斷裂等。根據(jù)ICHM7指南，本研究只關(guān)注有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的