熒光定量PCR引物設計原則

引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。

2.產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61KJ/mol）。

3.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。

4.G+C含量在40%~60%之間，45-55％最佳。

5.堿基要隨機分布，盡量均勻。

6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。

7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

8.引物5′端可以修飾。

9.3′端不可修飾，而且要避開AT,GCrich的區(qū)域，避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個）。

10.引物3′端要避開密碼子的第3位。

11.引物整體設計自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。

可用oligo6軟件進行比對看結(jié)果的情況。

12.做熒光定量產(chǎn)物長度80-150bp最好，最長是300bp.

13.引物設計避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。

14.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源。

15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似。

16.TM值在58-62度之間。

17.引物設計的軟件Primer5.0有專門針對熒光的。設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：①引物長度

一般引物長度為18~30堿基。總的說來，決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。

在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數(shù)值可能會有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應，使用確保退火溫度不低于54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。

總的說來，每增加一個核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要，主要與反應效率有關。由于熵的原因，引物越長，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。

②GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。

③退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。

④避免擴增模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域

選擇擴增片段時最好避開模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

⑤與靶DNA的錯配

當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個條帶出現(xiàn)。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測，網(wǎng)址：/BLAST/。選擇Aligntwosequences(bl2seq)，如下圖。

添加酶切位點是將PCR產(chǎn)物進行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點是六個堿基，另外在酶切位點的5’端還需要加2～3個保護堿基。但是不同的酶需要的保護堿基數(shù)目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保護堿基，EcoRⅤ需要1個，NotⅠ需要2個，HindⅢ3個。其中，在原核表達設計引物時還有一些小技巧，大家可以參考：《原核表達之實驗前的分析》。里面一些規(guī)則是所有表達都通用的。

有一種做法是在進行PCR反應的同時進行酶切，這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在PCR反應中的酶切反應率，見附錄。不過這種方法雖然方便但并不推薦。有時候，就是把PCR產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想，同步進行會使出現(xiàn)問題的原因變得更加復雜。一旦出現(xiàn)問題，分析起來更麻煩。

bLIC添加尾巴

LIC的全稱是Ligation-Independentcloning，它是Navogen公司專門為其部分的pET載體而發(fā)明的一種克隆方法。用LIC法制備的pET載體有不互補的12–15堿基單鏈粘端，與目的插入片段上相應粘端互補。擴增目的插入片段的引物5'序列要與LIC載體互補。T4DNA聚合酶的3'→5'外切活性經(jīng)短時間即可在插入片段上形成單鏈粘端。由于只能由制備好的插入片段和載體互相退火形成產(chǎn)物，這種方法非?？焖俑咝?，而且為定向克隆。

c定向TA克隆添加尾巴

在T載體剛出的時候大家都拍手稱贊，真是方便，哪個小子腦子這么聰明想出來的。但是后來人們發(fā)現(xiàn)TA克隆無法將片段定向克隆到載體中，所以后來Invitrogen推出了可以定向克隆的載體，它的一端含有四個突出的堿基GTGG。因此在PCR引物設計時也要相應的加上與之互補的序列，這樣片段就可以“有方向”了。

dIn-Fusion克隆方法

這項技術(shù)是Clontech還屬于BD的時候推出的。此技術(shù)就其步驟來說是及其方便的，不需連接酶，不需長時間的反應。只要在設計引物的時候引入一段線性化載體兩端的序列，然后將PCR產(chǎn)物和線性化的載體加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室溫下放置半個小時就可以進行轉(zhuǎn)化了。這種方法特別適合大批量的轉(zhuǎn)化。如果要加入額外的堿基總是或多或少會影響到整個PCR反應，比如在加入NotⅠ的酶切位點后整個引物的退火溫度就會直線上升（它