蛋白純化原理xjg

蛋白純化技術(shù)徐劍光2023.7.9第1頁(yè)Contents層析概述四大層析純化策略第2頁(yè)層析概述“色層分析”俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett于1923年首先提出原理：利用各組分在流動(dòng)相和固定相之間物理性質(zhì)（吸附、分派等）差異，對(duì)多組分混合物進(jìn)行分離辦法。常見(jiàn)：吸附層析，分派層析第3頁(yè)層析概述—參數(shù)與術(shù)語(yǔ)分離體積辨別率選擇性柱效對(duì)稱性線性流速載量第4頁(yè)層析概述—參數(shù)與術(shù)語(yǔ)VR=V0+kVi分離體積第5頁(yè)層析概述—參數(shù)與術(shù)語(yǔ)辨別率：辨別峰能力第6頁(yè)層析概述—參數(shù)與術(shù)語(yǔ)第7頁(yè)層析概述—參數(shù)與術(shù)語(yǔ)第8頁(yè)層析概述—參數(shù)與術(shù)語(yǔ)第9頁(yè)層析概述—參數(shù)與術(shù)語(yǔ)第10頁(yè)層析概述—塔板理論&速率理論塔板理論：將色譜柱假想為一種精餾塔，色譜柱中固定相形象化為一系列連續(xù)、相等體積塔板。每一塊塔板高度稱理論塔板高度H（板高）。第11頁(yè)層析概述—塔板理論&速率理論速率理論：吸取了塔板理論概念，并把影響塔板高度動(dòng)力學(xué)原因結(jié)合進(jìn)去，定量地解釋了影響塔板高度多種原因。其中：A、B、C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)阻力系數(shù)。上式即為范第姆特方程式簡(jiǎn)化式。第12頁(yè)層析概述—塔板理論&速率理論A=2λdp氣流遇到填充物顆粒時(shí)，不停變化方向，使試樣組分在氣相中形成紊亂類似渦流流動(dòng)。第13頁(yè)層析概述—塔板理論&速率理論色譜柱軸向分子擴(kuò)散（軸向擴(kuò)散）濃度梯度引發(fā)分子擴(kuò)散行為（濃差擴(kuò)散），造成峰展寬。B=2

Dg

：彎曲因子，反應(yīng)柱填充物對(duì)分子擴(kuò)散妨礙程度Dg：試樣組分分子在氣/液相中擴(kuò)散系數(shù)(cm2·s-1)第14頁(yè)層析概述—塔板理論&速率理論傳質(zhì)阻力——傳質(zhì)過(guò)程（平衡）中所受妨礙氣液界面氣相液相載氣第15頁(yè)四大層析凝膠過(guò)濾層析離子交換層析疏水層析親和層析第16頁(yè)四大層析—凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾層析：根據(jù)分子大小來(lái)分離生物分子一種簡(jiǎn)單可靠層析技術(shù)。第17頁(yè)四大層析—凝膠過(guò)濾層析怎么做？懂得分子量大小和差異（相差一倍以上）選擇合適填料選擇合適層析柱第18頁(yè)四大層析—凝膠過(guò)濾層析主要應(yīng)用：組分離

脫鹽/緩沖液置換精細(xì)分離

聚集體清除，分離不一樣分子大小蛋白檢測(cè)用途

計(jì)算分子量

純度檢測(cè)

第19頁(yè)四大層析—凝膠過(guò)濾層析試驗(yàn)步驟：平衡-上樣-洗脫-再生第20頁(yè)四大層析—離子交換層析離子交換層析：

根據(jù)不一樣生物分子所帶電荷性差異進(jìn)行分離一種辦法。正負(fù)電荷互相吸引第21頁(yè)四大層析—離子交換層析原理——蛋白質(zhì)荷電滴定曲線第22頁(yè)四大層析—離子交換層析第23頁(yè)四大層析—離子交換層析怎么做？選擇離子交換填料

陽(yáng)離子/陰離子，強(qiáng)/弱選擇緩沖液

PH，緩沖體系，添加劑選擇洗脫方式

線性洗脫or步級(jí)洗脫第24頁(yè)四大層析—疏水作用層析疏水作用層析：

根據(jù)生物分子之間疏水性差異進(jìn)行分離一種辦法。第25頁(yè)四大層析—疏水作用層析疏水作用層析原理：第26頁(yè)四大層析—疏水作用層析疏水作用填料：第27頁(yè)四大層析—疏水作用層析怎么做？PH，溫度，鹽種類第28頁(yè)四大層析—親和層析親和層析：通過(guò)生物分子間特異性互相作用來(lái)分離物質(zhì)一種辦法。第29頁(yè)四大層析—親和層析親和層析原理：第30頁(yè)四大層析—親和層析親和層析步驟：平衡上樣洗脫重生第31頁(yè)純化策略建立檢測(cè)辦法確立目標(biāo)（純度和產(chǎn)量）目標(biāo)蛋白性質(zhì)使用不一樣原理純化辦法減少步驟盡可能減少每步之間樣品條件變化選用高選擇性辦法工藝辦法盡可能簡(jiǎn)單….開(kāi)發(fā)純化辦法注意點(diǎn)：第32頁(yè)純化策略三步法：捕捉中度純化精純第33頁(yè)純化策略捕捉：速度，載量目：濃縮，穩(wěn)定蛋白第34頁(yè)純化策略中度純化：辨別率，載量目標(biāo)：清除主要雜質(zhì)第35頁(yè)純化策略精純：辨別率，收率目：除去痕量雜質(zhì)第36頁(yè)純化策略適用于三步純化策略層析技術(shù)：第37頁(yè)純化策略銜接層析技術(shù)時(shí)注意事項(xiàng)：第38頁(yè)純化策略設(shè)計(jì)合理純化線路：ACcaptureIntermediatepu