獸藥殘留-聚醚類殘留檢測課件

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理化性質(zhì)藥用機(jī)理代謝與殘留毒理特性前處理檢測方法聚醚類藥物殘留檢測理化性質(zhì)聚醚類藥物殘留檢測莫能菌素（Monensin）莫能菌素是從肉桂鏈的發(fā)酵產(chǎn)物中分離而得，為聚醚類離子載體抗生素的代表藥，一般用其鈉鹽。分子式:C36H61NaO11分子量:692.85結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有5個(gè)環(huán)醚環(huán)和1個(gè)螺縮酮體系。熔點(diǎn)：103～105℃，鈉鹽—267～269℃。旋光度：+47.7°溶解度：在甲醇、乙醇、氯仿中易溶，在苯、丙酮、四氯化碳中可以溶解，微溶于水。對溫度不敏感在飼料樣品中穩(wěn)定性較高。莫能菌素（Monensin）莫能菌素是從肉桂鏈的發(fā)酵產(chǎn)物中分沙拉菌素（Lasalocid）

鈉鹽性狀：白色至棕色粉末，有特異臭，

熔點(diǎn)191～192℃(分解)。

旋光度-30o(c=1，甲醇)。

紫外吸收光譜：308nm(ε4100)。溶解度：微溶于水，可溶于大部分有機(jī)溶劑。

性能穩(wěn)定，37℃下可保存6個(gè)月不變，25℃下保存18月不變。分子式C43H72O11分子量765.05沙拉菌素（Lasalocid）鈉鹽性狀：白色至棕色粉末，有鹽霉素(salinomycin)分子式:C42H69NaO11分子量:772.98鈉鹽性狀：白色或淡黃色結(jié)晶性粉末。熔點(diǎn)：140～142℃℃溶解性：易溶于丙酮、三氯甲烷、苯、乙酸乙酯、乙醚和甲醇，微溶于正己烷，幾乎不溶于水。制成的沙利霉素鈉，稍有特異臭味，易溶于丙酮、乙醚、氯仿幾乎不溶于水。鹽霉素白色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，具有特殊的環(huán)狀構(gòu)，是典型的離子載體抗生素。鹽霉素(salinomycin)分子式:C42H69Na馬杜霉素（Maduramicin）性狀：白色結(jié)晶粉末，有特殊臭味，溶解情況：不溶于水，可溶于大部分有機(jī)溶劑。熔點(diǎn)：305-310℃馬杜霉素（Maduramicin）抗菌藥離子載體類抗生素，化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有許多醚基和一個(gè)一元有機(jī)酸，其結(jié)構(gòu)能強(qiáng)烈地與球蟲細(xì)胞中的陽離子緊密結(jié)合，從而改變細(xì)胞膜上脂質(zhì)屏障的滲透性，抑制了胞子體和裂殖體正常的離子平衡，終致殺死球蟲。2.飼料添加劑提高瘤胃丙酸產(chǎn)量，促進(jìn)畜禽生長發(fā)育和提高飼料利用率。

藥用機(jī)理抗菌藥藥用機(jī)理代謝與殘留

主要代謝方式是O一脫甲基，其他包括羥化、脫羧、氧化(成酮)及葡萄糖醛酸結(jié)合等。馬杜霉素在火雞中的主要代謝途徑是脫一個(gè)或多個(gè)甲氧基，其次是羥化或與葡萄糖醛酸結(jié)合。

聚醚類離子抗生素在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，絕大部分藥物及其代謝產(chǎn)物經(jīng)膽管排泄，最終隨糞便排出體外。其中，肝臟和脂肪殘留物濃度最高，其次為腎臟、肌肉和血漿。

一般肝臟中主要以代謝物形式存在，脂肪中主要以原形藥物形式存在。絕大部分被吸收的PEs在肝組織內(nèi)被迅速代謝并失去活性，隨膽汁排泄。代謝與殘留主要代謝方式是O一脫甲基，其他包括羥化、脫羧、氧毒理特性

PEs的中毒劑量與安全劑量非常接近．在生產(chǎn)實(shí)際中，添加過量或拌料不均引起雞中毒現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。

Laczay報(bào)道，飼料中高劑量的PEs主要通過干擾動(dòng)物細(xì)胞的離子平衡和能量代謝而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞出現(xiàn)變性或壞死。一些對ATP依賴性強(qiáng)的組織最敏感，如心肌、膈肌等。

食入殘留有PEs的食物可引起人血管舒張，特別是誘發(fā)心臟冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張和血流量增加；當(dāng)患有冠狀動(dòng)脈疾病的人群，食入過多殘留有PEs的食物后，可引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張，心臟局部缺氧加重，使病情惡化。毒理特性PEs的中毒劑量與安全劑量非常接近．在生產(chǎn)實(shí)際中，聚醚類抗生素在毒理學(xué)上屬于高毒或劇毒物質(zhì)，具有強(qiáng)細(xì)胞毒性，安全范圍小。過量使用聚醚類抗生素會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品中藥物殘留，嚴(yán)重危害人體健康。加拿大、中國、歐盟和美國等許多國家或國際組織制定了聚醚類抗生素殘留限量。各國對動(dòng)物源性產(chǎn)品中聚醚類抗生素的殘留限量要求均低于1.0mg／kg。歐盟規(guī)定牛奶中莫能菌霉素限量為0.002mg／kg。毒理特性聚醚類抗生素在毒理學(xué)上屬于高毒或劇毒物質(zhì)，具有強(qiáng)細(xì)胞毒性，檢測方法如何檢測？微生物法色譜法薄層色譜法高效液相色譜法免疫分析法毛細(xì)管電泳一電導(dǎo)分離分析聯(lián)用法

高效液相色譜一質(zhì)譜(HPLC-MS)高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測方法如何檢測？微生物法檢測物質(zhì)—原型。結(jié)構(gòu)特征是在直鏈碳骨架上連成含氧雜環(huán)。分子一端有1個(gè)羧基，在中性或堿性環(huán)境中穩(wěn)定，其游離酸穩(wěn)定性較差。微溶或不溶于水，易溶于低級醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等。前處理溶劑提取固相萃取C18柱OasisHLB柱硅膠柱氧化鋁柱檢測物質(zhì)—原型。前處理溶劑提取固相C18柱稱取5.0g肌肉、肝臟或脂肪組織剪碎樣品，置于25mL聚四氟乙烯離心管中，加入10mL重蒸餾水，高速勻漿1min。加入10mL異辛烷，旋渦攪拌3min，1500r/min離心5min，上清液備用。向沉淀物中再分別加入10mL異辛烷，重復(fù)萃取兩次，合并三次離心后的上清液。稱取0.5g含水5%的硅膠裝入底部帶有玻璃砂墊的層析柱中，輕輕敲勻，上部放約0.5cm高度的無水硫酸鈉。用5mL異辛烷預(yù)洗硅膠柱，不使流干，加入離心所得的上清液。用10mL二氯甲烷洗滌雜質(zhì)，用6mL二氯甲烷／甲醇（體積比90／10)）洗脫，洗脫液收集于15mL玻璃雞心瓶中。洗脫液于40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用1mL甲醇／水（體積比90／10)溶解，0.45um微孔有機(jī)濾膜過濾，濾液備HPLC檢測之用。——高效液相色譜檢測雞肉中聚醚類抗生素前處理稱取5.0g肌肉、肝臟或脂肪組織剪碎樣品，置于25mL聚前處理提取液態(tài)奶類樣品：量取10．0mL液態(tài)奶試樣于50mL聚丙烯離心管中，加無水Na：SO。約10g和乙腈20mL，渦旋混勻1min，振蕩10min，以3000r／min離心3min，取出上層清液。用20mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。加10mL乙腈飽和的正己烷，渦旋1min，棄去正己烷，減壓濃縮至近干。用4mLV(甲醇)：V(水)=50：50混合液溶解殘?jiān)?，待凈化。奶粉類樣品：?2．5g奶粉于燒杯中，加適量35—50℃水溶解，待冷卻至室溫后，用水定容至100mL，充分混勻。取10．0mL樣品溶液于50mL聚丙烯離心管中，按液態(tài)奶類樣品提取步驟處理。將樣品溶液加載到固相萃取小柱中，并用3mLV(甲醇)：V(水)=50：50混合液淋洗至濃縮瓶，并入小柱。依次用5mL水和3mLV(甲醇)：V(水)=50：50混合液淋洗小柱。用氮?dú)獯蹈蓛x將洗脫液吹干，并迅速用流動(dòng)相定容至1．0mL，濾膜過濾，用于UPLC—MS／MS測定。——超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中聚醚類抗生素前處理提取液態(tài)奶類樣品：量取10．0mL液態(tài)奶試樣于50檢測方法微生物法色譜法薄層色譜法高效液相色譜法免疫分析法毛細(xì)管電泳一電導(dǎo)分離分析聯(lián)用法

高效液相色譜一質(zhì)譜(HPLC-MS)高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測方法微生物法微生物法原理：抗生素抑制微生物生長，根據(jù)對抗生素敏感的實(shí)驗(yàn)菌，在適當(dāng)條件下所產(chǎn)生的抑菌圈大小與抗生素濃度成正相關(guān)的關(guān)系而設(shè)計(jì)的。管碟瓊脂擴(kuò)散法1.試料的制備2.樣品處理3.雙碟的制備：將檢定培養(yǎng)基融化,置水浴中冷卻至55～64℃,加入菌懸液(每100mL培養(yǎng)基加0.6～0.8mL枯草芽孢桿菌（CMCC63202）)，搖勻，吸取6.0mL置平皿中，使其均勻攤布，待凝固15min后備用。微生物法原理：抗生素抑制微生物生長，根據(jù)對抗生素敏感的實(shí)驗(yàn)菌4.測定：每個(gè)雙碟中放置5個(gè)圓濾紙片，每個(gè)濾紙片間距10mm以上,用微量移液器分別在5個(gè)濾紙片上加空白添加試料、空白試料、磷酸鹽緩沖液(pH6.0)、判定試驗(yàn)試料、供試試料各90μL。每個(gè)試料至少重復(fù)2個(gè)雙碟，置(55±2)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6h。5.結(jié)果判定：采用微生物效價(jià)法測定，培養(yǎng)后采用多功能微生物自動(dòng)測量分析儀進(jìn)行測量并統(tǒng)計(jì)其抑菌圈直徑的大小。根據(jù)供試試料中供試試料中有無抑菌圈、抑菌圈大小和空白添加劑抑菌圈大小比較，判斷陰性或陽性。微生物法

有良好的劑量關(guān)系，微生物篩選方法抑菌圈與實(shí)際藥物含量的相關(guān)性好。具有很大的廣泛性，因?yàn)槿魏慰咕幬锛盎钚砸志煞侄寄芤种莆⑸锏纳L。用微生物法檢測動(dòng)物性組織中的獸藥殘留時(shí)，前處理簡單、不需特殊設(shè)備，可用于快速篩選大量的樣品。4.測定：每個(gè)雙碟中放置5個(gè)圓濾紙片，每個(gè)濾紙片間距10薄層色譜法（TLC）原理：馬杜霉素沒有明顯的紫外吸收和電化學(xué)特性，不能直接采用紫外或電化學(xué)的手段來測定其含量。用香草醛一濃硫酸一甲醇溶液顯色，在薄層掃描儀上對斑點(diǎn)進(jìn)行掃描定量，樣品經(jīng)過丙酮簡單提取后測定。薄層掃描法1.薄層板的清潔：以氯仿：甲醇(8：2)為展開劑，反復(fù)展開2—3次，去除潛在的雜質(zhì)污染。干燥。2.展開劑：乙酸乙酯：氯仿(2：1)3.顯色劑的配制：香草醛39ml，濃硫酸1ml，甲醇100ml，混合溶解配成溶液，臨用時(shí)新配。4.對照品溶液的配制：分別稱取馬杜霉素對照品適量，用丙酮溶解并稀釋，配成一系列濃度的對照品溶液。薄層色譜法（TLC）原理：馬杜霉素沒有明顯的紫外吸收和電化學(xué)薄層色譜法5.樣品溶液的配制：取己均質(zhì)或勻漿后的樣品適量，用丙酮提取．過濾，取濾液，必要時(shí)進(jìn)行濃縮并定容，溶劑仍然是丙酮，即得。6.點(diǎn)樣：用定量毛細(xì)管或平頭微量注射器吸取樣品，于薄層板離邊緣2．5cm處的直線上，每隔1cm，點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)。7.展開：將薄層板置于展開槽中，當(dāng)溶劑前沿到達(dá)距點(diǎn)樣原點(diǎn)10cm時(shí)，取出．晾干。8.顯色：驅(qū)盡薄層板上的殘余溶劑，用香草醛溶液，在距離30～50cm處。向薄層板均勻噴霧，不宜過多，然后置干燥箱中，在90℃加熱5—10分鐘，取出，再補(bǔ)噴，至斑點(diǎn)盡顯。以斑點(diǎn)附近無污染為度。9.薄層掃描：將顯色后的層析板置于雙波長薄層掃描儀上，掃描斑點(diǎn)，測定反射光吸收度。

TLC無需衍生化，可以簡化前處理過程，成本低，本方法可試用于飼料和動(dòng)物組織中馬杜霉素殘留的快速測定。薄層色譜法5.樣品溶液的配制：取己均質(zhì)或勻漿后的樣品適量，用高效液相色譜法(HPLC)

因莫能菌素和鹽霉素缺乏紫外、熒光和電化學(xué)特性，需要用HPLC柱后衍生法將其衍生化后被紫外可見檢測器檢測，故用甲醇-水分別分離提取試樣中的莫能菌素和鹽霉素，以甲醇-冰乙酸-水做流動(dòng)相，香草醛做衍生物，用高效液相色譜-柱后衍生化-紫外檢測法分離測定。

陳明等建立的飼料中聚醚類抗生素的柱后衍生方法可同時(shí)檢測飼料中的莫能菌素和鹽霉素，試驗(yàn)采用兩個(gè)柱后衍生反應(yīng)器，使莫能菌素和鹽霉素在柱后分離后與衍生試劑1（硫酸）和衍生試劑2（香草醛）在不同的反應(yīng)器中先后分別發(fā)生反應(yīng)，其特異性強(qiáng)，樣品峰分離效果好，基本無雜質(zhì)干擾，分析結(jié)果穩(wěn)定。

HPLC方法的靈敏度、特異性都非常高，速度快，樣品需量少，容易回收，色譜柱可反復(fù)使用，并可以準(zhǔn)確的定性、定量。高效液相色譜法(HPLC)因莫能菌素和鹽霉素缺乏紫外、熒光原理：在熔融石英毛細(xì)管

中，以Tris—醋酸—檸橄酸為電泳運(yùn)行介質(zhì)，分離電壓+12.0kV，采用毛細(xì)管電泳—電導(dǎo)法建立鹽霉素的分離檢測方法。實(shí)驗(yàn)方法：毛細(xì)管柱在使用前用蒸餾水和電泳運(yùn)行液各沖洗約5分鐘。檢測電極用超聲波進(jìn)行沖洗。電泳運(yùn)行液為1Ommol/LTris+2mmol/LHAc+0.2mmol/LCit。采用重力進(jìn)樣方式，進(jìn)樣時(shí)間20s，分離電壓+12kV.實(shí)驗(yàn)在室溫(25℃)，濕度<70%的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行。該方法快速、簡便、靈敏。毛細(xì)管電泳一電導(dǎo)分離檢測原理：在熔融石英毛細(xì)管中，以Tris—醋酸—檸橄酸免疫分析法

Kleiner等用建立的放射免疫測定法（RIA）檢測動(dòng)物組織中的馬杜霉素殘留，靈敏度極高，檢測限在0.025㎎/㎏一下，完全可以滿足動(dòng)物組織中馬杜霉素殘留檢測的要求，但是RIA法需要專門的檢測儀器，且需合成其放射降解物，較為繁瑣和危險(xiǎn)，目前應(yīng)用不廣。

IAC/ELISA法測定肉雞組織中的馬杜霉素殘留，用混合酸酐法和活化酯法合成４種馬杜霉素結(jié)合抗原。用其中一種作免疫原，免疫家兔產(chǎn)生抗體；用其余三種作包被原，探討不同包被原用于ELISA檢測馬杜霉素殘留時(shí)，對其靈敏度(I50)和方法回收率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，馬杜霉素結(jié)合抗原免疫家兔制備的抗體對馬杜霉素具有很高的特異性、親合性和選擇性。

ELISA方法盡管能滿足檢測限的要求．但由于抗原抗體反應(yīng)受環(huán)境影響因素較大，且抗體活性隨時(shí)間推移下降很快，在實(shí)際應(yīng)用中該方法一般僅作為快速篩選的方法。免疫分析法Kleiner等用建立的放射免疫測定法（RIA）2006年國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的動(dòng)物源產(chǎn)品中聚醚殘留量測定方法也是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（適用于禽、兔等動(dòng)物源產(chǎn)品中莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素殘留的確證和定量測定）原理：試樣中的聚醚類殘留，采用異辛烷提取，提取液用硅膠柱凈化，再在液相色譜