色譜分離技術(shù)-各種色譜分離（藥物分離純化課件）

藥物分離與純化技術(shù)課程色譜分離技術(shù)--分配色譜分配色譜—色譜分離技術(shù)大綱1.分配色譜概念2.分配色譜分類3.分配色譜總結(jié)分配色譜—色譜分離技術(shù)分配色譜的固定相由一種多孔固體（如硅膠、纖維素、硅藻土等）吸附著一種溶劑構(gòu)成，因此又稱為液液色譜。固定相中的固體本身對分離不起作用，僅起一個(gè)支持作用，故又稱為“支持劑”或“載體”。

當(dāng)被分離的混合物在流動相的攜帶下通過固定相時(shí)，根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶（或部分互溶）的兩液體中的分配系數(shù)不同，而實(shí)現(xiàn)分離的方法，稱為分配色譜。（一）分配色譜概念分配色譜—色譜分離技術(shù)在分配色譜中，溶質(zhì)在固定相和流動相之間的平衡關(guān)系同樣服從分配定律。其定義式為：Kd=cs/cm；式中：Kd為分配系數(shù)；cs為固定相中的濃度；cm為流動相中的濃度

分配系數(shù)Kd越大，固定相中被分離組分的濃度越大，其保留值越大，移動速度越慢，可定性反映出色譜柱的分離效能。（一）分配色譜概念分配色譜—色譜分離技術(shù)

根據(jù)固定相和流動相之間相對極性的大小，可將分配色譜法分成正相分配色譜法和反相分配色譜法兩類。

（1）正相分配色譜法的流動相極性低而固定相極性高，因此固定相對于極性強(qiáng)的組分有較大的保留值，常用于分離強(qiáng)極性化合物。（2）反相分配色譜法的流動相極性大于固定相極性，因此固定相對于極性弱的組分有較大的保留值，適于分離弱極性的化合物。（二）分配色譜分類分配色譜—色譜分離技術(shù)在強(qiáng)極性的流動相中加入與被測離子電荷相反的平衡離子而實(shí)現(xiàn)色譜分離的方法稱為反相離子對色譜法。

它使用普通的反相柱，還可以進(jìn)行梯度洗脫，可適用于易電離的有機(jī)化合物的分離分析，如核酸、核苷、兒茶酚胺、生物堿等。（二）分配色譜分類分配色譜—色譜分離技術(shù)分配色譜法的分離機(jī)制、分離過程、公式、固定相、流動相、洗脫順序等的總結(jié)歸納：（三）分配色譜法總結(jié)藥物分離與純化技術(shù)課程色譜分離技術(shù)--凝膠色譜凝膠色譜—色譜分離技術(shù)大綱1.凝膠色譜概念2.凝膠色譜分離原理3.凝膠色譜分類4.凝膠色譜特點(diǎn)凝膠色譜—色譜分離技術(shù)凝膠色譜是利用固定相中的微孔，根據(jù)各組分分子大小的不同，來實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離，又稱為凝膠過濾色譜、尺寸排阻色譜和空間排阻色譜或分子篩色譜。固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)。（一）凝膠色譜概念凝膠色譜—色譜分離技術(shù)凝膠色譜分離原理如圖所示。柱內(nèi)裝有凝膠顆粒，凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)被分離的混合物流過色譜柱時(shí)，各組分分子存在兩種運(yùn)動，即垂直向下的移動和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動。（一）凝膠色譜分離原理凝膠色譜—色譜分離技術(shù)由于混合物中含有大、小不同的分子，在隨流動相移動時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，而是隨流動相在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；

比凝膠孔小的分子以不同的擴(kuò)散程度進(jìn)入凝膠顆粒的微孔內(nèi)，使其向下移動的速度較慢，在色譜柱中逐漸將大分子物質(zhì)拉開距離，最終達(dá)到分離的目的。（二）凝膠色譜分離原理凝膠色譜—色譜分離技術(shù)凝膠色譜法主要用于分離分析相對分子質(zhì)量較高（即>2000）的化合物，如脫鹽、分級分離和分子量的確定等。脫鹽是分離大小不同的兩類分子的操作，如無機(jī)鹽與生物大分子。

（三）凝膠色譜應(yīng)用凝膠色譜—色譜分離技術(shù)分級分離是將分子大小相近的物質(zhì)分開。對于球形蛋白分子，在排斥極限和滲透極限之間，保留值與相對分子質(zhì)量的對數(shù)之間存在線性關(guān)系，據(jù)此可測定相對分子質(zhì)量。（三）凝膠色譜應(yīng)用凝膠色譜—色譜分離技術(shù)采用凝膠色譜法，能簡便快速地對分子量相差較大的混合物進(jìn)行分離；對于復(fù)雜的未知樣品，可采用凝膠色譜法進(jìn)行初步分級分離，無需進(jìn)行復(fù)雜實(shí)驗(yàn)，就能獲得樣品組成分布方面較為全面的概況。（三）凝膠色譜應(yīng)用凝膠色譜—色譜分離技術(shù)凝膠色譜按其流動相的不同分為兩大類：一類是水相系統(tǒng)，稱為凝膠過濾色譜，其所用的凝膠是親水性的，適用于分離水溶性化合物；

另一類是有機(jī)相系統(tǒng)，稱為凝膠滲透色譜，其所用的凝膠是疏水性的，適用于分離油溶性的化合物。（二）凝膠色譜分類凝膠色譜—色譜分離技術(shù)

作為固定相的凝膠，其材料性質(zhì)、顆粒大小、孔徑、機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性及其均一性等，都對凝膠色譜分離的效果有重要的影響。

因此，凝膠的選擇必須根據(jù)被分離物質(zhì)分子的大小、形狀和分離要求的不同，選用不同的凝膠，同時(shí)還要考慮凝膠顆粒的大小對流速、壓強(qiáng)降和分離效果的影響。凝膠色譜—色譜分離技術(shù)凝膠色譜分離的特點(diǎn)：①凝膠為惰性物質(zhì)，不帶電荷，不與溶質(zhì)分子發(fā)生任何作用，因此分離條件溫和；②應(yīng)用范圍廣，可分離從幾百到數(shù)百萬分子量的分子；③設(shè)備簡單，易于操作，周期短，凝膠一般不需要再生即可反復(fù)適用。在生物物質(zhì)分離、制藥生產(chǎn)和科研中被廣泛應(yīng)用。（四）凝膠色譜分離的特點(diǎn)藥物分離與純化技術(shù)課程色譜分離技術(shù)--親和色譜親和色譜—色譜分離技術(shù)大綱1.親和色譜概念2.親和色譜分離原理3.親和色譜對載體的要求4.親和色譜特點(diǎn)5.親和色譜應(yīng)用親和色譜—色譜分離技術(shù)隨著生物技術(shù)的深入研究，人們認(rèn)識到生物體中許多大分子化合物，具有與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，如蛋白酶與輔酶、抗原和抗體、激素與其受體、核糖核酸與其互補(bǔ)的脫氧核糖核酸等體系，都具有這種特性，生物分子間的這種專一結(jié)合能力稱為親和力。親和色譜—色譜分離技術(shù)親和色譜：依據(jù)生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，采用一定技術(shù)，把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子，固定化后作為固定相，則含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相），流經(jīng)此固定相后，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來，此種分離技術(shù)稱為親和色譜。（一）親和色譜概念親和色譜—色譜分離技術(shù)如圖所示。（1）把具有特異親和力的一對分子的任何一方作為配基，在不傷害其生物功能的情況下，與不溶性載體結(jié)合，使之固定化，裝入色譜柱中；（2）然后把含有目的物質(zhì)的混合液作為流動相，在有利于固定相配基與目的物質(zhì)形成絡(luò)合物的條件下，進(jìn)入色譜柱。（二）親和色譜分離原理親和色譜—色譜分離技術(shù)如圖所示。（3）這時(shí)，混合液中只有能與配基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，形成絡(luò)合物的目的物質(zhì)被吸附，不能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的雜質(zhì)分子直接流出。（4）經(jīng)清洗后，選擇適當(dāng)?shù)南疵撘夯蚋淖兿疵摋l件進(jìn)行洗脫，使被分離物質(zhì)與固定相配基解離，即可將目標(biāo)產(chǎn)物分離純化。（二）親和色譜分離原理親和色譜—色譜分離技術(shù)一般情況下，需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物，選擇合適的親和配基來修飾固體粒子，以制備所需的親和吸附介質(zhì)（固定相）。固體粒子稱為配基的載體。作為載體的物質(zhì)要求：①不溶性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，滲透性好；②物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使用壽命長；（三）親和色譜載體的物質(zhì)要求親和層析純化蛋白親和色譜—色譜分離技術(shù)③具有親水性，無非特異性吸附；④含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，利于親和配基的固定化；⑤抗微生物和酶的侵蝕；⑥最好為粒徑均一的球形粒子。常用的載體有葡聚糖、聚丙烯酰胺等，近年來多孔硅膠和合成高分子化合物載體正在被開發(fā)應(yīng)用于親和色譜。（三）親和色譜載體的物質(zhì)要求親和色譜—色譜分離技術(shù)親和配基可選擇酶的抑制劑、抗體、蛋白質(zhì)A、凝集素、輔酶和磷酸腺苷、組氨酸和肝素等。當(dāng)配基的分子量較小時(shí)，將其直接固定在載體上，由于載體的空間位阻，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用，如圖中a所示。如果在配基與載體之間連接間隔臂，可以增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合，如圖中b所示。（三）親和色譜載體的物質(zhì)要求親和色譜—色譜分離技術(shù)如果在配基與載體之間連接間隔臂，可以增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合，如圖中b所示。（三）親和色譜載體的物質(zhì)要求親和色譜—色譜分離技術(shù)親和色譜專一性高，操作條件溫和，過程簡單，純化的倍數(shù)可達(dá)幾千倍級，能有效地保持生物活性物質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其回收率也非常高，對含量極少又不穩(wěn)定的生物活性藥物的分離，極為有效，它是一種專門用于分離純化生物大分子的色譜分離技術(shù)。（四）親和色譜特點(diǎn)親和色譜親和色譜—色譜分離技術(shù)親和色譜最初用于蛋白質(zhì)，特別是酶的分離和精制上，后來發(fā)展到大規(guī)模應(yīng)用于：酶抑制劑、抗體和干擾素等的分離精制上。

在生物化學(xué)領(lǐng)域，主要用于各種酶、輔酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分離分析。（五）親和色譜應(yīng)用親和色譜—色譜分離技術(shù)親和色譜必須要有特異的親和配體。事實(shí)上，不是任何生物大分子間都有特異的親和力，也很難找到適當(dāng)?shù)挠H和配體；另外，親和色譜必須針對某一被分離物質(zhì)而專門制備一種固定相，并尋找特定的色譜條件，因此親和色譜的應(yīng)用受到一定的限制。（五）親和色譜應(yīng)用藥物分離與純化技術(shù)課程色譜分離技術(shù)--幾種常見吸附劑的特性幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)大綱1.氧化鋁2.硅膠3.聚酰胺4.硅酸鎂5.活性炭6.大孔吸附樹脂幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)①是一種吸附力很強(qiáng)的極性吸附劑。②含水量越高，吸附能力越弱。③根據(jù)含水量的多少，分為I～V級。

市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種類型，粒度規(guī)格大多為100～150目?？赏ㄟ^活化或者去活化得到不同活度級別的氧化鋁。通常在400℃左右加熱6小時(shí)，可得I～I(xiàn)I級氧化鋁。1.氧化鋁幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)堿性氧化鋁（pH9～10）：適用于堿性物質(zhì)（如胺、生物堿）和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等），也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內(nèi)酯的水解、醇羥基的脫水、乙酰糖的去乙?；?、維生素A和K等的破壞等不良副反應(yīng)。所以，這些化合物不宜用堿性氧化鋁分離。酸性氧化鋁（pH3.5～4.5）：適用于酸性物質(zhì)如有機(jī)酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。1.氧化鋁幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)中性氧化鋁（pH7～7.5）：適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來分離弱的有機(jī)酸和堿等。1.氧化鋁幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)

硅膠是硅酸的部分脫水后的產(chǎn)物，其成分是SiO2·xH2O，又叫縮水硅酸。柱色譜用硅膠一般不含粘合劑。吸附能力決定于硅羥基數(shù)，吸附活性取決于含水量。

硅膠吸附力比氧化鋁弱，吸附能力與游離硅醇基的數(shù)量和含水量有關(guān)，含水量>17%則失去吸附能力，不可做吸附劑。硅膠的活化：將含水硅膠在100～110℃溫度下加熱30min，但溫度超過500℃硅膠將失去活性。2.硅膠幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)適用范圍：非極性和極性化合物，適用于芳香油、萜類、甾體、生物堿、強(qiáng)心甙、蒽醌類、酸性、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，以及有機(jī)金屬化合物等。不適用于堿性成分的分離。市售硅膠：

2.硅膠

硅膠G（加入粘合劑煅石膏14%～22%)；硅膠F（加入了紫外光下能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)）；硅膠H（不含粘合劑）；硅膠GF（含粘合劑和熒光物質(zhì)）；硅膠HF（不含粘合劑，含有熒光物質(zhì)）；硅膠S（含淀粉）。幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)色譜用聚酰胺主要有錦綸6（聚己內(nèi)酰胺）和錦綸66（聚己二酰己二胺）兩種，分子量一般在16000～20000，其親水性和親脂性均較好，因此既可分離水溶性成份，也可分離脂溶性成分?？扇苡跐恹}酸、甲酸及熱的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；對堿穩(wěn)定，對強(qiáng)酸可水解。聚酰胺色譜的原理：兼具吸附色譜和分配色譜的功能。采用強(qiáng)極性洗脫劑時(shí)主要為吸附色譜——正相色譜；采用弱極性洗脫劑時(shí)主要為分配色譜——反相色譜。3.聚酰胺幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)中性硅酸鎂的吸附特性介于氧化鋁和硅膠之間，主要用于分離甾體化合物和某些糖類衍生物。

為了得到中性硅酸鎂，用前先用稀鹽酸，然后用醋酸洗滌，最后用甲醇和蒸餾水徹底洗滌至中性。4.硅酸鎂幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)活性炭為非極性吸附劑，其吸附規(guī)律與硅膠、氧化鋁恰好相反。對非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和力，在水中對物質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)的吸附能力。常用于水溶液的脫色素，也可用于糖、環(huán)烯醚萜苷的分離純化等。5.活性炭幾種常見吸附劑的特性—色譜分離技術(shù)大孔吸附樹脂同時(shí)具有吸附性和分子篩性。一般非極性化合物在水中易被非極性樹脂吸附，極性物質(zhì)在水中易被極性樹脂吸附。物質(zhì)在溶劑中的溶解度大，樹脂對此物質(zhì)的吸附力就小，反之就大。

對非極性大孔吸附樹脂來說，洗脫溶劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。

該法可用于皂苷類成分的純化分離。6.大孔吸附樹脂藥物分離與純化技術(shù)課程色譜分離技術(shù)--吸附色譜吸附色譜—色譜分離技術(shù)大綱1.吸附色譜的原理2.吸附劑與洗脫劑3.影響吸附色譜分離的因素吸附色譜—色譜分離技術(shù)吸附色譜的固定相為固體吸附劑，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力?；旌衔锉涣鲃酉鄮胫鶅?nèi)，依據(jù)固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同，而使混合物分離的方法，稱為吸附色譜法。1.吸附色譜的原理吸附色譜—色譜分離技術(shù)吸附色譜分離的關(guān)鍵，是固體吸附劑的性能。常用的固體吸附劑有強(qiáng)極性硅膠、中等極性氧化鋁、非極性炭質(zhì)等。根據(jù)所用吸附劑和吸附力的不同，吸附色譜可分為：

(1)無機(jī)基質(zhì)吸附色譜；

(2)疏水作用吸附色譜；

(3)共價(jià)作用吸附色譜；

(4)金屬螯合作用吸附色譜；

(5)聚酰胺吸附色譜等。這些色譜分離方法作用機(jī)理和作用力不同，但都可看作是可逆的吸附作用。吸附色譜—色譜分離技術(shù)

根據(jù)待分離組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，選擇合適的吸附劑和洗脫劑是分離成敗的關(guān)鍵。(1)吸附劑的要求：①對樣品組分和洗脫劑，都不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在洗脫劑中也不會溶解。②對待分離組分能夠進(jìn)行可逆的吸附，同時(shí)具有足夠的吸附力，使組分在固定相與流動相之間能最快地達(dá)到平衡。

2.吸附劑與洗脫劑吸附色譜—色譜分離技術(shù)③顆粒形狀均勻，大小適當(dāng)，以保證洗脫劑能夠以一定的流速通過色譜柱。④材料易得，價(jià)格便宜無色，以便于觀察。常用吸附劑的種類：氧化鋁、硅膠、聚酰胺、硅酸鎂、滑石粉、氧化鈣（鎂）、淀粉、纖維素、蔗糖和活性炭等.2.吸附劑與洗脫劑吸附色譜—色譜分離技術(shù)(2)吸附劑的活度及其調(diào)節(jié)吸附劑的活性取決于它們含水量的多少，活性最強(qiáng)的吸附劑含有最少的水。吸附劑的活性一般分為五級，分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ表示。數(shù)字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ～Ⅲ。向吸附劑中添加一定的水，可以降低其活性。反之，如果用加熱處理的方法除去吸附劑中的部分水，則可以增加其活性，后者稱為吸附劑的活化。吸附色譜—色譜分離技術(shù)各種不同活度吸附劑的含水量如表所示:吸附色譜—色譜分離技術(shù)(3)洗脫劑：

溶劑（流動相）。流動相又稱為展開劑（溶劑），它是由一種或幾種溶劑混合組成，在分離過程中起到把物質(zhì)從固定相上洗脫下來的作用。流動相的選擇原則是相似相溶。

常用的單一流動相極性順序如下所示：

水>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>三氯甲烷>二氯甲烷>甲苯>苯>三氯乙烯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>石油醚。吸附色譜—色譜分離技術(shù)(3)洗脫劑以單一溶劑作洗脫劑時(shí)，溶劑組成簡單，分離重現(xiàn)性好，但其極性固定不變，因而洗脫能力有限，分離效果不佳。

實(shí)際操作中常采用二元、三元甚至多元溶劑組分，有時(shí)為了提高分離度，在洗脫劑中還需加入少許酸、堿，促使某些極性物質(zhì)的斑點(diǎn)集中。吸附色譜—色譜分離技術(shù)(3)洗脫劑

①混合溶劑的極性順序（極性依次增大）：

苯∶氯仿（1+1）→環(huán)己烷∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶丙酮（95+5）→苯∶丙酮（9+1）→苯∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶乙醚（9+1）→苯∶甲醇（95+5）→苯∶乙醚（6+4）→環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶乙醚（8+2）→氯仿∶甲醇（99+1）→苯∶甲醇（9+1）→氯仿∶丙酮（85+15）→苯∶乙醚（4+6）→苯∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶甲醇（95+5）→氯仿∶丙酮（7+3）→苯∶乙酸乙酯（3+7）→苯∶乙醚（1+9）→乙醚∶甲醇（99+1）→乙酸乙酯∶甲醇（99+1）→苯∶丙酮（1+1）