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文檔簡介
培養(yǎng)基的概念
培養(yǎng)基是指人工配制并滅菌的,適合微生物生長繁殖或生產代謝產物的,用于微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存的混合營養(yǎng)基質。因此,培養(yǎng)基必須具備微生物所需要的碳、氮、磷、硫等大量元素及微量元素、生長因子及水等,保持一定的參透壓,維持適合pH值,呈現(xiàn)適當?shù)奈锢砗蜔o菌狀態(tài)。
培養(yǎng)基分類:按成分劃分
(1)天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基含有各種天然物質,其成分及含量不確定,如蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米漿、麥芽浸膏等
(2)合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是由已知化學成分的營養(yǎng)物質組成的。由于微生物對營養(yǎng)要求的不同,它可以完全由無機鹽或無機鹽加有機化合物組成。(3)半合成培養(yǎng)基由部分天然材料和部分化學藥品組成的培養(yǎng)基稱為半合成培養(yǎng)基。由于多數(shù)微生物均能在此類培養(yǎng)基上生長,配制方便,成本低廉,所以生產或實驗中經(jīng)常用半合成培養(yǎng)基。按物理狀態(tài)劃分
(1)液體培養(yǎng)基用各種材料的抽提物或化學試劑按照一定比例配成的水溶液或液體狀態(tài)的營養(yǎng)基質叫液體培養(yǎng)基,微生物在液體培養(yǎng)基中靜止生長時,需氧微生物往往可在液面形成膜、島、環(huán),而液體仍清晰透明;厭氧或兼性厭氧微生物生長而導致液體混濁或有沉淀。
(2)固體培養(yǎng)基除了用固體物料加水或營養(yǎng)鹽構成的疏松固體培養(yǎng)基(如曲、固體酶制劑、醬)外,固體培養(yǎng)基主要是指在液體培養(yǎng)基中加入一定量的固化膠體物質而配制成的胨狀培養(yǎng)基。將微生物細胞接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),能形成一定特征的菌落或菌苔。固體培養(yǎng)基對于研究微生物的分離、純化、培養(yǎng)、保存、鑒定等均是不可缺少的。
按用途劃分
(1).基礎培養(yǎng)基是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基?;A培養(yǎng)基也可以作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分,再根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)需求,在基礎培養(yǎng)基中加入所需營養(yǎng)物質而制成特殊培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎培養(yǎng)基。
(2)富集培養(yǎng)基也稱營養(yǎng)培養(yǎng)基,在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,這些特殊營養(yǎng)物質包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等。富集培養(yǎng)基常用于營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物的培養(yǎng)。
(3)鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學物質,某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產生某種代謝產物,而這種代謝產物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學物質發(fā)生特定的化學反應,產生明顯的特征性變化,根據(jù)這種特征性變化,可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來。
(4)選擇培養(yǎng)基是用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)需求或對某種化學物質的敏感性不同,在培養(yǎng)基中加入相應的特殊營養(yǎng)物質或化學物質,抑制不需要的微生物的生長,有利于所需微生物的生長。配制培養(yǎng)基的基本原則
一、根據(jù)微生物的營養(yǎng)特點選擇營養(yǎng)物質
微生物營養(yǎng)類型不同對營養(yǎng)物質的需求不同,因此依據(jù)不同微生物的營養(yǎng)要求配制適宜的培養(yǎng)基是配制培養(yǎng)基的基本原則之一。
自養(yǎng)型微生物能從簡單的無機物合成自身的有機體,因此培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基可以由簡單的無機物組成。例如氧化硫硫桿菌培養(yǎng)基組成中,只有CO2、(NH4)2SO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、CaCL2、S和水等無機物,沒有加入任何有機化合物。多數(shù)藻類也是自養(yǎng)型微生物,它們的培養(yǎng)基組成也比較簡單,只需要無機營養(yǎng)物質而不需要有機營養(yǎng)物質。但是培養(yǎng)異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基需要添加無機物和有機物,而且不同類型的異養(yǎng)型微生物的營養(yǎng)要求差異很大。如培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基組成簡單,而培養(yǎng)腸膜明串珠菌的培養(yǎng)基成分非常復雜,僅生長因子多達33種。原生動物也是異養(yǎng)型微生物,需要較多的營養(yǎng)物質,如梨形四膜蟲的培養(yǎng)基含有10種氨基酸、7種維生素、鳥嘌呤、尿嘧啶及一些無機鹽等。二、控制營養(yǎng)物質的濃度和比例
營養(yǎng)物質濃度過低不能滿足微生物正常生長所需,太高則可能對微生物產生毒害,如高濃度的無機鹽、重金屬離子等會抑菌或殺菌。因此,營養(yǎng)物質合適的濃度是微生物生長發(fā)育的必要條件之一。在生產過程中,在不影響微生物的生理特性和代謝轉化率的情況下,通常趨向在較高濃度下進行生產,以提高產物產量,并盡可能選育高滲透壓的生產菌株。當然,培養(yǎng)基濃度太大會使培養(yǎng)基黏度增加和溶氧量降低。
營養(yǎng)物質之間應有適當?shù)谋壤?,尤其培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的碳氮比(C/N)在微生物培養(yǎng)中尤其重要。不同菌種、不同發(fā)酵產物所要求的碳氮比是不同的。菌體在不同生長階段,對其碳氮比的要求也不一樣。氮源過多,則菌體繁殖旺盛,pH值偏高,不利于代謝產物的積累;氮源不足,則菌體繁殖量少,從而影響產量。碳源過多,則容易形成較低的pH值;碳源不足,菌體衰老和自溶。三、控制酸堿度
各種微生物正常生長均有合適的pH值,一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境,放線菌和細菌適于中性或微堿性環(huán)境。為此,當培養(yǎng)基配制好后,若pH值不合適,必須加以調節(jié)。
四、控制氧化還原電位
不同微生物對氧化還原電位的要求不同,一般地,好氧型微生物氧化還原電位值大于+0.1V,最適值是+0.3~+0.4V,厭氧型微生物氧化還原電位值小于+0.1V。氧化還原電位的高低受氧氣分壓、pH值和微生物代謝產物的影響。通常增加通氣量或加入氧化劑,可以增加氧化還原電位值,加入還原劑如抗壞血酸、硫化氫、谷胱甘肽等可降低氧化還原電位值。
五、就地取材
在大規(guī)模生產中培養(yǎng)基用量很大,在選用培養(yǎng)基原料時應就地取材,盡量地利用當?shù)剌^豐富的廉價原料,設法降低成本。例如,賴氨酸生產中先選用山芋淀粉,后改為用山芋粉為碳源,這樣不僅價廉,而且山芋粉中還含有生物素、鎂鹽等,省去了原來所加的玉米漿、硫酸鎂,并使整個成本降低15%。六、滅菌處理
培養(yǎng)基混有環(huán)境中各種雜菌,必須對培養(yǎng)基滅菌才能避免外來雜菌的干擾。對培養(yǎng)基滅菌一般采用高壓蒸汽滅菌法,在121℃下維持15~30分鐘即可達到滅菌目的。
在高壓蒸汽滅菌過程中,長時間高溫會使不耐熱的糖類遭到破壞,形成氨基糖、焦糖。因此含糖培養(yǎng)基常在112℃下進行滅菌或過濾除菌后再與已滅菌的成分混合使用。長時間高溫還引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子結合,形成難溶性復合物,因此,常在培養(yǎng)基中加入少量螯合劑(如EDTA)或將發(fā)生反應的物質分開滅菌后混合都可以避免產生沉淀。培養(yǎng)基中泡沫的存在也對滅菌極為不利,應在培養(yǎng)基中加入消泡劑,減少或避免泡沫的產生謝謝高氏一號培養(yǎng)基配方
可溶性淀粉20g,KNO31g,K2HPO4·3H2O0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,NaCL0.5g,F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g,瓊脂20g,水1000ml,pH=7.4~7.6。制備流程及注意事項
1、稱量和溶化按配方和培養(yǎng)基需用量計算并稱取可溶性淀粉,放入小燒杯中,并用少量冷水將淀粉調成糊狀,再加入少于所需水量的沸水中,繼續(xù)加熱,使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱取其他各成分,并依次溶化,對微量成分FeSO4·7H2O可先配成0.01g/mL的貯備液,按比例換算后再加入。待所有試劑完全溶解后,補充水分到所需的總體積。配制固體培養(yǎng)基時,將稱好的瓊脂放入已溶解的試劑中,再加熱融化,最后補足水分。2、調pH用試紙測培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培養(yǎng)基中加入1mol/LNaOH,邊滴邊攪拌,并隨時用pH試紙測其pH,直至pH達7.6。反之,用1mol/LHCL進行調節(jié)。
3、分裝和加塞將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管內,剩余的培養(yǎng)基裝入三角瓶中,在試管口或錐形瓶口上塞上棉塞。4、包扎加塞后,將全部試管用麻繩捆好,再在棉塞外包一層牛皮紙,其外再用一根麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。
5、滅菌將上述培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋,以121℃,0.103MPa高壓蒸汽滅菌20~30min。
6、擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50℃左右,將試管口端擱在玻璃棒上。斜面的斜度要適當,使斜面的長度約為管長1/3~1/2。
7、無菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~28h,以檢查滅菌是否徹底,如果無菌生長即為滅菌完全。
謝謝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方:
牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCL5.0g,瓊脂15~20g,水1000ml,pH7.4~7.6。其中牛肉膏提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素,蛋白胨提供氮源和維生素,而NaCL提供無機鹽,在配制固體培養(yǎng)基時需要加入一定量瓊脂作凝固劑,如果配制液體培養(yǎng)基則不用加入瓊脂。制備步驟及注意事項
1.稱量(假定配制1000ml培養(yǎng)基)
依據(jù)培養(yǎng)基配方及所需培養(yǎng)基總量,計算并準確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL各自的量,放入燒杯(或鋼鍋)中。牛肉膏常用玻棒挑取,放在稱量紙上,稱量后直接放人水中,稍微加熱,牛肉膏便會與稱量紙分離,然后立即取出紙片。蛋白胨很容易吸濕,在稱取時動作要迅速。稱量時嚴防藥品混雜,如果用同一把角匙取用不同藥品時,稱取一種藥品后,將角匙洗凈擦干,再稱量另一藥品,同時瓶蓋也不要蓋錯。2.溶化
在燒杯(鋼鍋)中先加入所需要的水量,用玻棒攪勻,然后,在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解,將藥品完全溶解后,補充水到所需的總體積;如果配制固體培養(yǎng)基時,將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中,再加熱溶化,最后補足所需水分。在瓊脂溶化過程中,應控制火力,以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器,同時,不斷攪拌,以防瓊脂糊底燒焦。通常不用銅或鐵鍋加熱溶化,以免離子進入培養(yǎng)基中,影響細菌生長。3.調pH
在未調pH前,先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌,并隨時用pH試紙測其pH,直至pH達7.4~7.6。反之,用1mol/LHCl進行調節(jié)。對于要求pH較精確的培養(yǎng)基,其pH的調節(jié)常用酸度計進行。pH調節(jié)不要過頭,以避免回調而影響培養(yǎng)基內各物質的濃度。
4.過濾
趁熱用多層紗布過濾,除去雜質,以利實驗結果的觀察。不影響實驗結果時,可以省去過濾,本實驗不需過濾。5.分裝
液體培養(yǎng)基分裝高度以試管高度的1/4左右為宜,固體培養(yǎng)基不超過管高的1/5,半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜。分裝三角瓶的雖則根據(jù)需要而定,一般以不超過三角瓶容積的一半為宜。有的液體培養(yǎng)基在滅菌后,需要補加一定量的其他無菌成分,如抗生素等,則裝量一定要準確。分裝過程中,注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上,以免沾污棉塞而引起污染(6.加塞
培養(yǎng)基分裝完畢后,在試管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等),以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內面造成污染,并保證有良好的通氣性能。制作棉塞時,選用大小薄厚適中的普通棉花一塊,鋪展在左手拇指和食指形成的圓孔上,用右手食指將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞,直接壓入試管或三角瓶口。制成的棉塞要求不緊不松,兩頭光滑,試管棉塞的長度約3cm左右,塞入后,試管內部分約占2/3,管外頭部占1/3左右7.包扎
試管加塞后,以10多支為一組,在棉塞外包一層牛皮紙包扎成捆(圖4-8),注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、配制人備用。三角燒瓶加塞后,外包牛皮紙,用麻繩以活結形式扎好,同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、配制人備用。8.滅菌
將包扎好的培養(yǎng)基按照配方中規(guī)定的條件及時滅菌。普通培養(yǎng)基在l21℃下高壓蒸氣滅菌20min即可達到滅菌效果。
9.擺斜面
將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多),將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上,擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。10.無菌檢查
將滅菌培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24~48h,檢查確實無菌生長方可使用。謝謝PDA培養(yǎng)基配方:
馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來水1000毫升、自然pH。1、稱量和熬煮按培養(yǎng)基配方及制備量稱取洗凈去皮土豆適量,切成小塊放入鍋中,加入所需水量,加熱至沸騰,維持20~30min,用2層紗布趁熱過濾,濾渣棄取。濾液補足所需水分備用。
2、加熱溶解把濾液放入鍋中,加入所需葡萄糖、瓊脂,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,待瓊脂完全溶解后,再補充水分至所需量。3、分裝按實訓要求,將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml三角瓶內。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。分裝量:固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5,滅菌后制成斜面,分裝入三角瓶內以不超過其容積的一半為宜;半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜,滅菌后垂直待凝。4、加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢后,在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或試管帽等),以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內造成污染,并保證
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