羥苯磺酸鈣對2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的干預(yù)作用

羥苯磺酸鈣對2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的干預(yù)作用

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（parkinson）是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。這是世界上最常見和最嚴(yán)重的視覺缺陷和昏迷。1材料表面1.1實驗動物SPF級SD大鼠72只,體重230~270g,安徽省實驗動物中心,許可證號SCXK(皖)2005-001,室溫20~26℃,相對濕度為40%~70%,晝夜明暗交替,自然通風(fēng)加機械排風(fēng)飼養(yǎng)。1.2試劑盒和試劑鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司,批號S8060;丙二醛(MDA,批號20101221)、超氧化物歧化酶(SOD,批號20101220)、谷胱甘肽(GSH,批號20101118)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、糖基化產(chǎn)物(AGEs)一抗及SABC顯色試劑盒均購自北京博奧森。日立7020全自動生化分析儀;島津MK3酶標(biāo)儀;BX51Olympus熒光顯微鏡;萊卡TP1020脫水機。2方法2.1高脂飼料+普通飼料低脂飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,72只大鼠隨機分成2組,正常組22只,造模組50只,正常組普通飼料喂養(yǎng),造模組高脂飼料(豬油、雞蛋、蔗糖、膽固醇混合,2mL/只)+普通飼料喂養(yǎng)。3個月后,每只大鼠ipSTZ45mg·kg2.2指標(biāo)測定2.2.1大鼠視網(wǎng)膜中sod,mda,gsh的檢測實驗動物于給藥周期結(jié)束后摘除眼球,每組取10只大鼠的眼球做組織勻漿或離心后的上清液,紫外分光光度計法檢測SOD,MDA,GSH的含量。2.2.2視網(wǎng)膜pas染色實驗各組取4只大鼠眼球固定于10%甲醛溶液48h,去除眼前節(jié)成眼杯,桔瓣樣將眼杯切成3塊,分離出視網(wǎng)膜,水中沖洗24h,置入3%胰蛋白酶(Serva1:250)溶液中,于37℃條件下消化1~3h。當(dāng)視網(wǎng)膜組織溶解后,將標(biāo)本輕輕移入蒸餾水中,輕輕搖動,將視網(wǎng)膜內(nèi)界膜及殘存視網(wǎng)膜神經(jīng)成分等組織完全脫去,僅剩下一層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng),水洗移至載玻片上平鋪,自然干燥,常規(guī)PAS染色。顯微鏡觀察,在400倍下每個標(biāo)本任選一根視網(wǎng)膜主動脈干、從中心到外周成S形記數(shù)1000個毛細(xì)血管細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞E與周細(xì)胞P)并計算其比值E/P。2.2.3用免疫組織化學(xué)法檢測vegf和ages每組取8只大鼠眼球于40g·L2.2.4統(tǒng)計處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以x珋±s的形式表示,用t檢驗分析。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1兩組含量比較模型組SOD的活力,GSH,MDA的含量與正常組比較有顯著性差異。羥苯磺酸鈣組SOD的活力與模型組相比有顯著性差異,但GSH,MDA含量差異不明顯。見表1。3.2糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)的變化正常大鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)完整,視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管徑粗細(xì)均一,走向較直。毛細(xì)血管內(nèi)由周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞2種細(xì)胞成分組成,內(nèi)皮細(xì)胞,位于毛細(xì)血管中央,核較大,橢圓形或不規(guī)則形,染色稍淺;周細(xì)胞,多位于毛細(xì)血管一側(cè),核體積較小,染色深。糖尿病大鼠均出現(xiàn)了不同程度的視網(wǎng)膜血管形態(tài)改變,如毛細(xì)血管網(wǎng)排列紊亂,走向不規(guī)則,多根毛細(xì)血管扭曲成叢;毛細(xì)血管管腔粗細(xì)不等,或節(jié)段膨大,呈囊樣擴張;周細(xì)胞核明顯固縮,數(shù)目顯著減少,內(nèi)皮細(xì)胞明顯增生。羥苯磺酸鈣組治療2個月后,視網(wǎng)膜A,V間毛細(xì)血管網(wǎng)排列非常紊亂,扭曲,局部無細(xì)胞毛細(xì)血管連成網(wǎng),但整體血管改變較模型組明顯減輕。見圖1。3.3膜合板中皮細(xì)胞e和周細(xì)胞p的計數(shù)，以及網(wǎng)絡(luò)消化試驗中的e.p比較數(shù)量和e.p比較3.4免疫組織化學(xué)法檢測vegf蛋白表達(dá)正常對照組VEGF免疫陽性反應(yīng)分布于靠近視網(wǎng)膜內(nèi)核層的少數(shù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞漿中;DM組內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的表達(dá)增強,胞質(zhì)呈棕黃色,且陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)增多。而羥苯磺酸鈣灌胃組VEGF免疫陽性僅見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)中,陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于DM組,且較正常對照組陽性細(xì)胞數(shù)增多。正常組AGEs免疫陽性反應(yīng)分布于神經(jīng)纖維層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層;DM組內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的表達(dá)明顯增強,胞質(zhì)呈深棕黃色,陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)增多;羥苯磺酸鈣灌胃組內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的表達(dá)較模型組變化不大,較正常組陽性細(xì)胞數(shù)增多。見表3。4視網(wǎng)膜病變模型糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是在糖尿病(DM)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的,但得到與人類2型糖尿病DR相同的動物模型卻較困難。本研究將高脂高糖飼料與藥物干預(yù)相結(jié)合,采用SD大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)一段時間后產(chǎn)生胰島素抵抗,再給予的STZ,誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于人類2型DM的動物模型。最終形成DR。視網(wǎng)膜微循環(huán)內(nèi)屏障的破壞和血管通透性增加是糖尿病視網(wǎng)膜病變的標(biāo)志之一細(xì)胞因子VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要最直接的刺激血管因子氧自由基主要包括有超氧陰離子、過氧化氯和羥自由基等活性氧。本研究通過檢測SOD,GSH,MDA,結(jié)果表明模型組視網(wǎng)膜氧自由基產(chǎn)生過多且機體清除自由基能力下降,這些指標(biāo)的改變與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的生化特征類似。藥物組SOD的活力與模型組比較增強,說明羥苯磺酸鈣對SOD的活力可能存在一