毒理學(xué)指標(biāo)及試驗操作匯總

毒理學(xué)指標(biāo)及試驗操作匯總.藥物毒性試驗指標(biāo)1.急性毒性試驗一、半數(shù)致死量〔LD50〕的測定(一)目的:觀看受試物一次賜予動物后，所產(chǎn)生的毒性反響和死亡狀況。(二)動物分組和劑量動物:一般用小白鼠8周齡，體重18---22g(同次試驗體重相差不超過2g)大白鼠6~8周齡，體重120--150g，同次試驗體重相差不10g。受試物:溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混懸液.(三)試驗方法劑量:一般選用3一5個劑量，各劑量間劑距依據(jù)受試物狀況和預(yù)試結(jié)果而定。給藥途徑和容積:給藥途徑:應(yīng)與臨床試驗的途徑相全都?？诜幬飸?yīng)灌胃給藥，一、二類藥應(yīng)承受兩種途徑給藥，其中一種應(yīng)為推舉臨床爭論的給藥途徑。水溶性好的藥物還應(yīng)測定靜脈給藥的急性毒性。給藥容積:小白鼠禁食(12~16小時)，不禁水，按體重計算:灌胃(ig)不超過0.4ml/10g體重。大白鼠禁食(12~16小時)，不禁水、灌胃(ig3ml/只。測定LD:將動物按體重隨機分組，每組至少10只(雌雄各半)。給受試物后馬上觀看50動物反響狀況，每天觀看一次連續(xù)觀看七天。具體逐天記錄動物毒性反響狀況及死亡分布，并用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法(申LD95%可信限。50觀看毒性反響:給受試物后應(yīng)嚴(yán)密觀看反響狀況，并記錄動物的外觀、行為活動、精神狀態(tài)、食欲(飼料消耗量)、大、小便及其顏色、被毛、膚色、呼吸、鼻、眼、口腔有無特別分泌物，體重變化以及死亡等狀況。死亡動物應(yīng)準(zhǔn)時進展尸檢，覺察病變器官應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。假設(shè)覺察中毒反響或死亡率一與動物的性別有明顯相關(guān)時，則應(yīng)選擇性別敏感的動物進行復(fù)試。(四)試驗報告和結(jié)果評價應(yīng)具體具體，包括試驗日期、動物的規(guī)格、性別、數(shù)量、受試物來源及含量、試驗方法。LD值及其95%可信限，以及各劑量組的死亡率，或最大耐受量的值及其相當(dāng)于臨床劑量的50倍數(shù).具體報告試驗過程中動物消滅的中毒表現(xiàn)及致死病癥，綜合評價受試物毒性大小。二、最大耐受量〔MTD〕的測定方法:受試物可用臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度，最大容積的劑量一次或一日內(nèi)2~3次賜予動物(小白鼠至少20只，雌雄各半)。連續(xù)觀看七天，記錄動物反響狀況，以不產(chǎn)生死亡的最大劑量為最大耐受量。計算出總賜予藥量g/Kg(合生藥量g/Kg表示)，推算出相當(dāng)于臨床用藥量的倍數(shù)。測定最大耐受量，同樣也應(yīng)嚴(yán)密觀看動物毒性反響狀況，要求與觀看單次給藥的毒性反響一樣。..2.長期毒性試驗一、大鼠的長期毒性試驗(一)目的:觀看連續(xù)重復(fù)賜予受試物對大鼠所產(chǎn)生的毒性反響，首先消滅的病癥和嚴(yán)峻程度，毒副反響的靶器官及其恢復(fù)和進展?fàn)顩r。確定無毒反響劑量，為擬定人用安全劑量供給參考。(二)動物和材料動物安康大白鼠(參見總則要求)，每組至少20只。如試驗周期為三個月以上，應(yīng)依據(jù)需要增加數(shù)量至每組30~40只。體重差異應(yīng)不206~8大鼠。超過三個月。宜用5~6周齡大鼠，雌雄各半、隨機分組，每籠不超過5只，雌雄分籠飼養(yǎng)，試驗前至少觀看一周，記錄食量和體重等。(三)試驗方法1.劑量和分組一般設(shè)三個劑量組和一個比照組。高劑量組原則上要求使動物產(chǎn)生明顯的或嚴(yán)峻的毒性反響，或個別動物死亡。中劑量組應(yīng)相當(dāng)于藥效學(xué)試驗的高劑量.低劑量組略高于動物的有效劑量而不消滅毒性反響。假設(shè)急性毒性試驗結(jié)果毒性很低，測不出LD。也未見明顯毒性反響，可設(shè)高、低50兩個劑量組，高劑量組一般為擬用于臨床劑量50驗之高劑量。比照組的設(shè)置:如受試物為提取物(如浸膏)，比照物可考慮用常水;如含溶媒，比照物為溶媒;如含賦形劑，則比照物用賦形劑。如溶媒或賦形劑可能產(chǎn)生毒性時，則應(yīng)另加一空白對服組(常水)。給藥途徑與方法給藥途徑與推舉臨床的途徑全都?？诜幬飸?yīng)經(jīng)口給藥。臨床用藥途徑為靜脈注射時，可用其它適宜的注射途徑代替?？诜幋笫笠话阌霉辔阜?，也可將受試物混在飼料、水中賜予，但每只動物分籠飼養(yǎng)，實行適當(dāng)措施，保證每只動物按規(guī)定劑量在確定時限內(nèi)服入。受試物最好是每周7天連續(xù)賜予，如試驗周期在90天以上，可6給藥容量一般為1~2ml/l100g體重，每周可依據(jù)體重狀況調(diào)整給藥量，但總量不宜超過5ml/鼠/次。各劑量組用等容量不等濃度給藥。試驗周期長毒試驗的給藥時間應(yīng)為臨床試驗用藥期的二~三倍，最長半年。假設(shè)臨床用藥周期在1周以內(nèi)者，長毒試驗應(yīng)為2周;2周以內(nèi)者，應(yīng)為四周;四周以上者，長期毒性試驗的給藥期一般為臨床試驗用藥期的兩倍以上。(四)檢查工程一般觀看:進食量、體重、外觀體征和行為活動、糞便性狀等，覺察有中毒反響的動物應(yīng)取出單籠飼養(yǎng)，重點觀看。覺察死亡或瀕死動物應(yīng)準(zhǔn)時尸檢。檢測工程;血液學(xué)指標(biāo):紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞分類、血小板計數(shù)、凝血時間。血液生化學(xué)指標(biāo):天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT),堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN),總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血澹(GLU)、總膽紅素(T-BIL)、肌醉(Grea)、...總膽固醇(T-CHO)。系統(tǒng)尸解和病理組織學(xué)檢查:①系統(tǒng)尸解:應(yīng)全面細(xì)致，覺察特別器官應(yīng)重點進展病理組織學(xué)檢查。②臟器稱重和勝器系數(shù);剖解后取出心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、攀丸、卵巢、子宮、腦、前列腺。③病理組織學(xué)檢查:高劑量組比照組動物及尸檢覺察特別器官檢查要具體。其他劑量組可取材保存。在高劑量組覺察有特別病變時才進展檢查。檢查內(nèi)容除一類其他各類藥:心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、胃、胸腺、肇丸(和附肇)Y可逆性觀看24(2/3~1/2)，檢測各2~4周。如24小時后的病理學(xué)檢查覺察有特別變化，應(yīng)將余下動物活殺剖檢，重點觀看毒性反響器官，以了解毒性反響的可逆程度和可能消滅的緩慢性毒性。指標(biāo)觀看時間一般狀況和病癥的觀看，每天觀看一次。每周記錄飼料消耗和體重一次。試驗周期在三個月以內(nèi)的，一般在最終一次給藥后24小時和恢復(fù)期完畢時各進展一次各項指標(biāo)的全面檢測.必要時，在試驗中間檢測指標(biāo)一次。試驗周期在三個月以上的，可在試驗中期活殺少量動物(高劑量組和比照組)全面檢測各項指標(biāo)。對瀕死或死亡動物應(yīng)準(zhǔn)時檢查。二、犬的長期毒性試驗?zāi)康?觀看連續(xù)重復(fù)賜予受試物對犬所產(chǎn)生的毒性反響，首先消滅的病癥和嚴(yán)峻程度，供給毒副反響的靶器官及其恢復(fù)和進展?fàn)顩r，確定無毒反響劑量，為擬定人用安全劑量供給參考。皮膚用藥毒性試驗?zāi)康?觀看動物完整皮膚及破損皮膚短時期接觸受試物所產(chǎn)生的毒性反響。粘膜用藥的毒性試驗?zāi)康?觀看動物跟睛接觸受試物后所產(chǎn)生的刺激反響狀況和恢復(fù)狀況。特別毒性試驗依據(jù)《藥審批方法》及《有關(guān)中藥局部的修訂和補充規(guī)定冷各類型中藥藥在特別毒性試驗方面應(yīng)做工程如下:一類藥必需進展特別毒理爭論。保胎藥與影響胎兒子代發(fā)育的藥物，除按一般毒理學(xué)要求進展試驗外，還應(yīng)增做生殖毒性試驗。其它類藥如在試驗中覺察有影響生殖或致癌的可疑性時，應(yīng)補做相應(yīng)的特別毒性試驗。一、致突變試驗中藥一類藥，除按藥理、毒理學(xué)要求進展試驗外，還需做基因突變試驗，染色體畸變試驗及動物微核試驗。由于中藥制劑有其特別性，如含有生藥粉的制劑，不溶物較多;或...因成分簡潔，溶解度較差，以及pH等間題的爭論，難以進展體外試驗者，可只做體內(nèi)試驗。(一)基因突變試驗基因突變試驗的目的是反映受試物在基因水平上的致突變作用。主要方法有三種:其中微生物回復(fù)突變試驗適合于化學(xué)純度高的藥物，較為常用;中藥粗制品不宜做微生物回復(fù)突變試驗，哺乳動物培育細(xì)胞突變試驗適用于受試物本身具有抗微生物作用的藥品;果蠅伴性隱性致死試驗是整體動物的基因突變試驗，準(zhǔn)確性較高，在上述二法有某些陽性或可疑陽性時較為適用。果蠅伴性隱性致死試驗1.果蠅:Oregon一RMuller5雌蠅。2.給藥途徑:口服或其他接近臨床用藥的途徑。劑量:至少二個劑量。最高劑量為最大耐受劑量或產(chǎn)生某些毒性1/2LD為基準(zhǔn)，低劑量為1/4LD，無毒物最大給藥量可用最大耐受5050試驗:毒性試驗:求出半數(shù)致死量。生殖力試驗觀看受孕與不育狀況。如有不育，可調(diào)低劑量。(3)樣本的大小:受試染色體總數(shù)試驗和陰性比照組6000以上，陽性比照組3002一3天更處女蠅，記錄雌性子代的致死作用。報告將數(shù)據(jù)列成表，包括受試染色體數(shù)，給藥的和無生育力的雄性數(shù)，F(xiàn)2代培育群的數(shù)目，每一生殖細(xì)胞期檢測的帶有致死基因的染色體數(shù)。判定:一支培育管中，F(xiàn):代合計有2(i只以上雌、雄蠅而末覺察有野生型紅眼雄蠅者為陽性:反之，有2只以上雄蠅者為陰性。在一支培育管中，F(xiàn):代雌、雄蠅合計少于}a只，或只有一只紅眼雄蠅者為可疑，需觀看F3代。僅存雌、雄蠅親本而無仔蠅者為不育。7，統(tǒng)計處理及評價:致死突變率%=致死管數(shù)/受試染色體數(shù)×100%致死突變率大于自發(fā)突變率的2倍并有劑量反響關(guān)系時記為陽性。或?qū)⒔o藥組與比照組的致死突變率進展比較，如比照組與給藥組的突變總數(shù)小于1}},按}astenbaum-Bowman方法統(tǒng)計，總數(shù)大于iaa按}z統(tǒng)計。(二)染色體畸變試驗染色體畸變試驗的目的是反映受試物在染色體水平上的致突變作用，其中培育細(xì)胞染色體畸變試驗是體外試驗，對受試物的純度及理化性質(zhì)要求較高，而精原細(xì)胞染色體畸變試驗及嚙齒動物顯性致死試驗均為體內(nèi)試驗，前者需用小鼠數(shù)較少，試驗周性較短，后者雖然工作量較大，但同時可獲得受孕率，死胎數(shù)，含死胎孕鼠百分率等較多信息.嚙齒類動物顯性致死試驗:11520劑量:一般承受3個劑量。受試物的最高劑量應(yīng)導(dǎo)致毒性病癥或削減生殖力，低毒物最大劑量可用最大耐受量比照用溶劑及陽性比照。給藥途徑與方法盡可能和臨床擬用途徑一樣。一般承受一天一次，連續(xù)五天給藥或其它適宜的給藥方式。...交配方法:骨髓采樣時間:通過預(yù)試，在12-72h不同時間內(nèi)，取5個作用24h劑量及劑量級:至少承受3個劑量，最高劑量以1/2LD或最大耐受量為基準(zhǔn)，否則應(yīng)50說明選定劑量的理由。比照組:用溶媒及陽性比照。標(biāo)本制作:取骨髓、涂片、Giernsa或叮吮橙熒光染色鏡檢:每只動物至少計數(shù)100個多染紅細(xì)胞，Giemsa染色，觀看其微核消滅的頻度及多染紅細(xì)胞和正常紅細(xì)胞的比率。吖啶橙熒光染色，則直接觀察微核消滅的頻度。判定:(1)受試物所誘發(fā)的微核率的增加與劑量相關(guān);(2)某一測試點微核增加呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計學(xué)意義的