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文檔簡介

營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選實驗七營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選實驗七營養(yǎng)缺陷型等基本概念與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體:野生型:指從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生人為營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。遺傳型表示法是[A+B+]

營養(yǎng)缺陷型:野生型菌株經(jīng)誘變處理后,由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變,因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長。

A營養(yǎng)缺陷型用[A-B+]表示,B營養(yǎng)缺陷型用[A+B-]表示原養(yǎng)型:一般指營養(yǎng)缺陷型突變經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株,其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。遺傳型均用[A+B+]表示營養(yǎng)缺陷型等基本概念與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體:與營養(yǎng)要求有關(guān)的3種遺傳型關(guān)系與營養(yǎng)要求有關(guān)的3種遺傳型關(guān)系培養(yǎng)基的基本概念

(按營養(yǎng)需求成分分)與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基:

基本培養(yǎng)基(MM):僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基。——不同菌株的要求不同,此試驗要先確定,非常重要。完全培養(yǎng)基(CM):凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基:凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的基本概念

(按營養(yǎng)需求成分分)與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大,主要有兩方面應(yīng)用:1、是作為研究代謝途徑和遺傳規(guī)律及育種技術(shù)不可少的標(biāo)記菌種;2、可直接用于生產(chǎn)氨基酸、核苷酸等代謝產(chǎn)物——目的在于切斷某些代謝途徑以積累中間代謝產(chǎn)生或切斷一條代謝途徑而積累另一分支途徑的末端產(chǎn)生?!獬x途徑中的反饋抑制和阻遏。營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大,目的要求1、了解應(yīng)用物理、化學(xué)因素對細(xì)菌進(jìn)行誘變的方法。2、初步掌握誘變產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選與鑒定的方法技術(shù)。體會其相應(yīng)的科學(xué)理念。目的要求1、了解應(yīng)用物理、化學(xué)因素對細(xì)菌進(jìn)行誘變的方法。實驗原理

——誘變及誘變劑說明利用化學(xué)、物理等誘變手段誘發(fā)突變是遺傳學(xué)研究和育種工作的常用手段。主要有DNA堿基化學(xué)性質(zhì)改變引起置換、插入移碼、大片段畸變、堿基二聚體形成等。最終引起遺傳信息在復(fù)制中的改變。本次實驗利用紫外線進(jìn)行誘變處理(主要是形成嘧啶二聚體,引起后續(xù)DNA復(fù)制錯誤,達(dá)到誘變的目的)。誘變后需要暗培養(yǎng)(防止光復(fù)活作用)。紫外線劑的控制——紫外燈的功率、照射距離、照射時間?!ㄐ枰捌谠囼灤_定,殺菌率在70%左右)實驗原理

——誘變及誘變劑說明利用化學(xué)、物理等誘變手段誘發(fā)突實驗原理

——營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)生長情況營養(yǎng)缺陷型在完全培養(yǎng)基(CM)上生長良好,而在基本培養(yǎng)基(MM)上則不生長;未發(fā)生突變的野生型在兩種培養(yǎng)基上都能生長?!Y選的理論依據(jù)實驗原理

——營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)生長情況營養(yǎng)缺陷型在完全培養(yǎng)基實驗原理

——營養(yǎng)缺陷型篩選的四個環(huán)節(jié)第一步:誘變劑處理第二步:淘汰野生型,濃縮缺陷型——基本培養(yǎng)基(使?fàn)I養(yǎng)缺陷型由少數(shù)變?yōu)槎鄶?shù))

抗生素法:青霉素適用于細(xì)菌;制霉菌素適用于真菌

菌絲過濾法:適用于絲狀生長的真菌和放線菌高溫殺菌法:利用芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異。第三步:檢出缺陷型第四步:鑒定營養(yǎng)缺陷型(此步因時間關(guān)系不再進(jìn)行)實驗原理

——營養(yǎng)缺陷型篩選的四個環(huán)節(jié)第一步:誘變劑處理實驗材料菌種:大腸桿菌實驗培養(yǎng)基:肉湯液體培養(yǎng)基(CM);肉湯固體培養(yǎng)基(CMA);2倍肉湯液體培養(yǎng)基(2×CM);基本液體培養(yǎng)基(MM);基本固體培養(yǎng)基(MMA);無N基本液體培養(yǎng)基(無N);2倍含N基本液體培養(yǎng)基(2×N)實驗試劑:生理鹽水;青霉素鈉實驗器材:10mL帶蓋離心管、10mL吸管、90mm培養(yǎng)皿、15×150mm試管(帶硅膠塞)、1mL刻度吸管(或微量加樣槍和吸頭)實驗材料菌種:大腸桿菌實驗步驟1、菌種培養(yǎng)收集洗滌2、誘變劑處理3、淘汰野生型,濃縮缺陷型——基本培養(yǎng)基

抗生素法:青霉素適用于細(xì)菌;制霉菌素適用于真菌

菌絲過濾法:適用于絲狀生長的真菌和放線菌4、檢出缺陷型——夾層培養(yǎng)法5、鑒定營養(yǎng)缺陷型(此步驟因時間關(guān)系不再進(jìn)行)——下學(xué)期《微生物學(xué)實驗》中有相關(guān)內(nèi)容學(xué)習(xí)實驗步驟1、菌種培養(yǎng)收集洗滌1、菌種培養(yǎng)收集洗滌

(第一天)大腸桿菌接種于肉湯液體培養(yǎng)基,37℃靜止培養(yǎng)18~24小時(老師處理)。無菌取10mL培養(yǎng)液放入無菌15mL離心管中,3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,棄上清液,留下菌體沉淀。在上述沉淀中加入5mL無菌生理鹽水,懸浮沉淀(均勻),備用。1、菌種培養(yǎng)收集洗滌

(第一天)大腸桿菌接種于肉湯液體培養(yǎng)基2、誘變劑處理(第一天)吸取上述洗滌懸浮好的菌懸液3mL,放至60mm培養(yǎng)皿中,搖晃成薄層。將上述培養(yǎng)皿(連蓋)放在40W的紫外燈下,距離30厘米(處理前先開紫外燈穩(wěn)定30分鐘),滅菌1分鐘,然后開蓋處理5分鐘。照射完畢后,先蓋上皿蓋,再關(guān)紫外燈。吸取3毫升2倍肉湯培養(yǎng)液到上述處理后的培養(yǎng)皿中。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),避光培養(yǎng)12小時以上?!T變后DNA復(fù)制形成純合子過程。注意紫外線防護(hù)(不要長時間暴露在其下)。2、誘變劑處理(第一天)吸取上述洗滌懸浮好的菌懸液3mL,放3、淘汰野生型,濃縮缺陷型

(第二天)(1)吸5毫升紫外線處理過并重新培養(yǎng)的菌液,放入已滅菌的15mL離心管,3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。(2)倒去上清液,加入5mL生理鹽水,打散混勻沉淀,如此重復(fù)離心洗滌三次,加生理鹽水到原體積(5mL)。(3)吸取經(jīng)離心洗滌的菌液0.1毫升于5毫升無N基本培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)12~24小時?!睜I養(yǎng)情況下休眠菌體(饑餓處理)。3、淘汰野生型,濃縮缺陷型

(第二天)(1)吸5毫升紫外線處3、淘汰野生型,濃縮缺陷型

(第三天)(4)培養(yǎng)24小時后,按1∶1加入2N基本培養(yǎng)液5毫升(含青霉素鈉鹽2000單位/毫升),使青霉素鈉在菌液中的最終濃度約為1000單位/毫升,再放入37℃溫箱中培養(yǎng)?!们嗝顾刂蛔饔糜谏L的細(xì)胞,殺死在基本培養(yǎng)基中生長的野生型,留下休眠不生長的缺陷型。(5)培養(yǎng)24小時后,3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,用基本液體培養(yǎng)基重復(fù)離心洗滌三次,懸浮于5mL基本培養(yǎng)液,備用?!コ嗝顾剽c(第四天內(nèi)容)3、淘汰野生型,濃縮缺陷型

(第三天)(4)培養(yǎng)24小時后,4、檢出缺陷型——夾層培養(yǎng)法

(第四天)取1無菌培養(yǎng)皿,倒入5mL滅菌溶化后基本固體培養(yǎng)基(MMA),鋪滿鋪平培養(yǎng)皿皿底,凝固后形成底層?!谝粚尤∩弦徊襟E處理好后的菌懸液0.1mL加入到5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃基本固體培養(yǎng)基(MMA)中(試管),快速搓動混勻后(快速),倒入上述有底層的培養(yǎng)皿中,鋪滿鋪平,冷卻凝固?!诙永鋮s凝固后,再倒入5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃基本固體培養(yǎng)基(MMA),鋪滿鋪平,冷卻凝固。——第三層放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48小時。4、檢出缺陷型——夾層培養(yǎng)法

(第四天)取1無菌培養(yǎng)皿,倒入培養(yǎng)好后,仔細(xì)觀察培養(yǎng)皿,標(biāo)記已生長出的菌落。標(biāo)記好后,倒入5mL滅菌溶化后冷卻至45-50℃肉湯固體培養(yǎng)基(CMA),鋪滿鋪平,冷卻凝固?!谒膶印诹靸?nèi)容放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48小時?!诎颂靸?nèi)容再次仔細(xì)觀察培養(yǎng)好培養(yǎng)皿,前后對照標(biāo)記,找出新生長出的菌落,此菌落可能是缺陷型菌落。如有新生長出的菌落,用無菌牙簽(接種針),挑取菌落,分別點(diǎn)接于含基本固體培養(yǎng)基(MMA)和肉湯固體培養(yǎng)基(CMA)培養(yǎng)皿上,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48小時。觀察,如果在基本固體培養(yǎng)基(MMA)無生長,而肉湯固體培養(yǎng)基(CMA)生長,則得到營養(yǎng)缺陷型菌株,保藏進(jìn)行鑒定營養(yǎng)缺陷型。反之失敗。培養(yǎng)好后,仔細(xì)觀察培養(yǎng)皿,標(biāo)記已生長出的菌落。夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果示意圖夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果示意圖5、鑒定營養(yǎng)缺陷型利用生長譜法確定所挑取菌株具體缺少什么營養(yǎng)物而不能生長。生長譜法:在混有供試菌(待鑒定菌)的平板表面點(diǎn)加相應(yīng)微量營養(yǎng)物,視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌(微型菌落圈)來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。下學(xué)期《微生物學(xué)實驗》再具體詳細(xì)介紹。5、鑒定營養(yǎng)缺陷型利用生長譜法確定所挑取菌株具體缺少什么營養(yǎng)附:檢出營養(yǎng)缺陷型的方法介紹夾層培養(yǎng)法——四層培養(yǎng)基(三基本一完全)限量補(bǔ)充培養(yǎng)法——微量富(限)營養(yǎng)物逐個檢出法——滅菌接種針或牙簽,分別接種于基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基影印平板法——分別轉(zhuǎn)印于基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上附:檢出營養(yǎng)缺陷型的方法介紹夾層培養(yǎng)法——四層培養(yǎng)基(三基本夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果夾層培養(yǎng)法先在培養(yǎng)皿上倒一層MM瓊脂培養(yǎng)基,凝固后倒上一層含菌的MM瓊脂培養(yǎng)基,凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)24hr,將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記,然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基,再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。缺點(diǎn):結(jié)果有時不明確,而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。夾層培養(yǎng)法先在培養(yǎng)皿上倒一層MM瓊脂培養(yǎng)基,凝固后倒上一層含限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

——營養(yǎng)不同,生長差異該法有兩種情況:(1)目的是檢出營養(yǎng)缺陷型(廣泛)將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含有0.01%蛋白胨的MM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),野生型迅速長成大菌落,而生長緩慢的小菌落可能是營養(yǎng)缺陷型。(2)目的是定向篩選某種特定的缺陷型(特定)在基本培養(yǎng)基中加入某種單一(微量)的氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)。限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

——營養(yǎng)不同,生長差異該法有兩種情況:逐個檢出法(點(diǎn)接)用接種針或牙簽將誘變處理后CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種(先MM后CM,操作時要避免帶入CM培養(yǎng)基成分),依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種,然后一起培養(yǎng),觀察其生長情況。此法結(jié)果明確,但工作量大。CMMM逐個檢出法(點(diǎn)接)用接種針或牙簽將誘變處理后CM上長出的菌落影印平板法(1)將一較培養(yǎng)皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨,用金屬夾夾住,滅菌。(2)完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓,使之成為印模,標(biāo)記方位。(3)將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓,此菌印模即復(fù)印于上。(4)將CM和MM在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(5)二平皿相同

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