第二章-固液分離和細胞破碎課件

第二章固液分離和細胞破碎第二章固液分離和細胞破碎1主要內(nèi)容2.1發(fā)酵液的預(yù)處理2.1.1發(fā)酵液的特性2.1.2發(fā)酵液預(yù)處理的目的2.1.3發(fā)酵液預(yù)處理方法2.2固液分離工程及設(shè)備2.3細胞破碎主要內(nèi)容2.1發(fā)酵液的預(yù)處理22.1發(fā)酵液的預(yù)處理2.1.1發(fā)酵液過濾特性培養(yǎng)液的組成：

水(高達90-99%

)+ 固體細胞及碎片20-30%(對微生物發(fā)酵)+ 少量的代謝成物+ 細胞破裂后的內(nèi)容物+ 殘存的培養(yǎng)基成分2.1發(fā)酵液的預(yù)處理2.1.1發(fā)酵液過濾特性培養(yǎng)液的組成3微生物發(fā)酵液的特性為：發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。微生物發(fā)酵液的特性為：42.1.2預(yù)處理的目的改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中（多數(shù)為液相）；除去發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。2.1.2預(yù)處理的目的改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進從懸浮液5發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）雜蛋白在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力;在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清。在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。

在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。發(fā)酵液的相對純化發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）在6(一)高價無機離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；Fe3+——黃血鹽(亞鐵氰化鉀)，→普魯士蘭沉淀(一)高價無機離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→7(二)雜蛋白的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點。1)沉淀法(二)雜蛋白的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。8酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀。在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀。92)變性法

加熱，大幅度調(diào)節(jié)pH值，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。不足之處加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。

2)變性法加熱，不足之處加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)10加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。例如：在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。

3)吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。3)吸附法112.1.3發(fā)酵液預(yù)處理的方法：

加熱法調(diào)整pH凝聚與絮凝使用惰性助濾劑加入反應(yīng)劑2.1.3發(fā)酵液預(yù)處理的方法：12（1）加熱法最簡單和價廉的預(yù)處理方法，即將懸浮液加熱到所需溫度并保溫適當時間?？捎行Ы档蛻腋∫旱酿ざ龋⒓铀倬奂饔靡匀コ承╇s蛋白；降低懸浮液的最終體積，（1）加熱法13（2）調(diào)整pHpH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染；細胞、細胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。（2）調(diào)整pH14（3）凝聚與絮凝采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。凝聚——指在投加的化學(xué)物質(zhì)（如鋁、鐵的鹽類或石灰等）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小塊狀凝聚體的過程。絮凝——指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠體顆粒交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團的過程。（3）凝聚與絮凝15①凝聚

發(fā)酵液中的細胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序為：

Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚劑電解質(zhì)有：

硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O(明礬)氯化鋁AlCl3?6H2O三氯化鐵FeCl3硫酸亞鐵FeSO4·7H2O石灰；ZnSO4；MgCO3①凝聚16②絮凝絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如-COOH）或陽離子（如-NH2）基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。②絮凝171）有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑：有機合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型、陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：1）有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物18聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹慎。聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點用量少，一般以mg/L計量；聚丙烯酰19對于帶負電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。③混凝對于帶負電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時20(4)加入助濾劑一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過濾阻力。常用的助濾劑有：硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。使用硅藻土時，通常細粒用量為500g/m3；中等粒度用量為700g/m3；粗粒用量為700-1000g/m3。(4)加入助濾劑21(5)加入反應(yīng)劑加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能。若發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率；如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。

(5)加入反應(yīng)劑222.2固液分離工程及設(shè)備2.2固液分離工程及設(shè)備23重力沉降浮選旋液分離介質(zhì)過濾離心通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。用于固液比重差小、直徑5～30μm顆粒的分離，污水處理懸浮液以較高速度沿切線方向進入旋風分離器，輕相由分離器中央排出，重相由分離器下部排出，但不適合直徑<5μm顆粒去除（可用絲網(wǎng)分離器）。工業(yè)上常用霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發(fā)酵液采用過濾方法；細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，其發(fā)酵液采用高速離心分離，如對發(fā)酵液進行預(yù)處理，也可用過濾進行固液分離。2.2.1固液分離的方法重力沉降通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。懸浮液以較24微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進行分離的過程。在過濾操作中，要求濾速快、濾液澄清，并且有高的收率。D.過濾微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以251)過濾分類澄清過濾：過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆粒活性炭、玻璃珠、塑料顆粒等，當懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，適合于固體含量少于0.1g/100ml、顆粒直徑在5-100um的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。1)過濾分類澄清過濾：26濾餅過濾：過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。當濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾，在濾餅過濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100ml的懸浮液的過濾分離。濾餅過濾：27E.離心分離在液相非均一系統(tǒng)中，利用離心力達到液-液、液-固、液-液-固分離的方法，統(tǒng)稱為離心分離。優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：設(shè)備投資高、能耗大。離心機種類：碟片式離心機、管式離心機、傾析式離心機。E.離心分離在液相非均一系統(tǒng)中，利用離心力達到液-液、液-28離心分離因數(shù)f=Gu2gRGgR(2πRn)260GRn2900===GDn21800重量kg旋轉(zhuǎn)直徑轉(zhuǎn)速r/min離心分離因數(shù)：又稱為離心力強度，表示在離心機中產(chǎn)生的離心加速度與自由下降的加速度之比。離心分離因數(shù)f=Gu2G(2πRn)2GRn2===GDn2291）切向流過濾,又稱錯流過濾

交叉過濾和十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。2）雙水相萃取

向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合物，重相中富含鹽類或另一種高分子化合物，從而達到分離和提純某種高分子化合物的目的。3）吸附法

向細胞碎片懸浮液中加入某種固體吸附劑，或者用細胞碎片懸浮液通過裝有吸附劑的固定床，即可達到除去細胞碎片的目的。主要的問題是很難選擇合適的吸附劑，以保證目的產(chǎn)物不被吸附而損失。其他固液分離方法1）切向流過濾,又稱錯流過濾其他固液分離方法302.2.2常用過濾設(shè)備(1)板框壓濾機廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。優(yōu)點:過濾面積大，結(jié)構(gòu)簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強。缺點:不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動強度大，衛(wèi)生條件差，非過濾的輔助時間較長。2.2.2常用過濾設(shè)備(1)板框壓濾機廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制31單元組成板布板布板操作注意點盡量使工作時間和輔助時間接近；降低濾液粘度單元組成板操作注意點盡量使工作時間和輔助時間接近；32濾漿洗水濾板濾框洗板濾布濾漿洗水濾板濾框洗板濾布33第二章-固液分離和細胞破碎ppt課件342023/7/31轉(zhuǎn)筒真空過濾機結(jié)構(gòu)示意圖動盤定盤轉(zhuǎn)筒金屬網(wǎng)濾布濾餅攪拌器洗滌噴頭料漿槽刮刀轉(zhuǎn)筒，扇形格(18格)

濾室；分配頭；動盤定盤金屬網(wǎng)；濾布；濾漿槽。(2)真空轉(zhuǎn)鼓過濾機2023/7/31轉(zhuǎn)筒真空過濾機結(jié)構(gòu)示意圖動盤定盤轉(zhuǎn)筒金屬網(wǎng)35第二章-固液分離和細胞破碎ppt課件36離心機工業(yè)用離心機按結(jié)構(gòu)和分離要求，可分為過濾離心機、沉降離心機和分離機三類。離心機工業(yè)用離心機按結(jié)構(gòu)和分離要求，可分為過濾離心機、沉降離37第二章-固液分離和細胞破碎ppt課件38第二章-固液分離和細胞破碎ppt課件392.3細胞破碎方法破碎率：被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分數(shù)。N0：原細胞數(shù)，N：破碎后殘存的正常細胞。N0和N的可通過直接計數(shù)和間接計數(shù)法得到。2.3細胞破碎方法破碎率：被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的402.3.1 細胞破碎理論

1)、細胞破碎A壓撞B剪切Ca滲透Cb凍脹D破壁破膜2.3.1 細胞破碎理論1)、細胞破碎41超聲波法高壓勻漿機組織搗碎機細菌磨珠磨法反復(fù)凍融法滲透壓沖擊法冷熱變替法有機溶媒法自溶法酶法機械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法細胞破碎法2.3.2 細胞破碎方法

超聲波法反復(fù)凍融法有機溶媒法機械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法細42

超聲波破碎超聲波破碎原理：超聲波作用下液體發(fā)生空穴化作用，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。超聲空化：存在于液體中的微小氣泡（空化核）在超聲場的作用下振動、生長并不斷聚集聲場能量，當能量達到某個閾值時，空化氣泡急劇崩潰閉合的過程。超聲波破碎超聲波破碎原理：超聲波作用下液體發(fā)生空穴化作用，產(chǎn)43第二章-固液分離和細胞破碎ppt課件44優(yōu)點：適合于多種細胞的破碎缺點：A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀；B、超聲產(chǎn)生超氧離子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、產(chǎn)熱大，需控溫；E、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。優(yōu)點：適合于多種細胞的破碎45第二章-固液分離和細胞破碎ppt課件46

高壓勻漿破碎原理：主要利用細胞懸液在高壓作用下液相剪切力以及細胞與固定表面的撞擊力而使之破碎。特點：適用于酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎，不宜用于團狀或絲狀菌的破碎；由于操作中溫度會升高，需對料液作冷卻處理，保護目的產(chǎn)物活性。適合于工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用高壓勻漿破碎高壓勻漿破碎原理：主要利用細胞懸液在高壓作用下液相剪切47

珠磨法破碎原理：利用在高速攪拌作用下，細胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。珠磨機可用于酵母和細菌，但對真菌菌絲和藻類更合適.特點：適用范圍較廣；但有效能量利用率很低，設(shè)計操作時應(yīng)充分考慮冷卻系統(tǒng)的熱交換能力；影響破碎率的操作參數(shù)較多，過程優(yōu)化設(shè)計較復(fù)雜。珠磨法破碎珠磨法破碎原理：利用在高速攪拌作用下，細胞和微球相互磨擦48操作：細胞噴霧高速凍結(jié) 300m/s氮氣流

優(yōu)點：A、細胞破碎僅發(fā)生在撞擊的一瞬間，破碎程度均勻，避免反復(fù)和過度破碎；B、破碎的程度可無級調(diào)節(jié)，避免細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，特別適合于細胞器的回收；C、實驗室和工業(yè)規(guī)模均可應(yīng)用，細胞濃度在10-20%，實驗室規(guī)模的間歇處理能力在50-500mL/h，工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理在10,000mL/h以上。撞擊法破碎操作：細胞噴霧高速凍結(jié)撞擊法破碎49反復(fù)凍融法于將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。冷熱變替法將材料投入沸水中，于90℃左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。滲透壓沖擊法細胞在高滲透壓介質(zhì)中平衡后，再突然將其轉(zhuǎn)至低滲透壓環(huán)境中，水會大量進入細胞，使細胞壁和膜脹破。（2）物理破碎法反復(fù)凍融法（2）物理破碎法50又稱化學(xué)滲透：其原理是利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細胞壁或細胞膜結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶出速率；或者完全溶解細胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使細胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。優(yōu)點：A、產(chǎn)品釋放的選擇性；B、提取速度和收效高；C、產(chǎn)品的破壞??；D、對外界環(huán)境，如pH和溫度等要求低；E、不殘留細胞碎片。（3）化學(xué)破碎法又稱化學(xué)滲透：其原理是利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細胞壁或細51粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。有機溶媒法粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌52將待破碎的鮮材料在一定pH和適當?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞?nèi)含物釋放出來。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)防止細菌污染。自體融解過程中pH顯著變化，隨時要調(diào)節(jié)pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時較少用。自溶法將待破碎的鮮材料在一定pH和適當?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶?3能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。1g菌體加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h內(nèi)完全溶菌。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。酶法能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。1g54一、細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)

細菌類結(jié)構(gòu)—多層三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)溶菌酶對革蘭氏陽性細菌的破碎效果最好一、細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)—多層三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)溶菌酶對革蘭氏552