基因工程的常規(guī)技術(shù)教學(xué)課件

基因工程的常規(guī)技術(shù)第五講基因工程的常規(guī)技術(shù):Directionotelectrophoreses第一節(jié)核酸的分離純化Extraction&Purificationofnucleicacid核酸分離、純化原則L保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性Ⅱ防止核酸的生物降解、分離提取核酸的主要步驟L.細(xì)胞的破碎Ⅱ核蛋白的解聚、變性蛋白的去除Ⅱ核酸的沉淀ⅣV.核酸的濃度測定V核酸的保存、核酸分離、純化原則(一)保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中,核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。分離核酸原則:①溫度不要過高②控制一定的pH值范圍(pH值5-9)③保持一定的離子強(qiáng)度④減少物理因素對核酸降解的機(jī)械剪切力(二)防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸酯鍵,破壞核酸一級結(jié)構(gòu)所用器械和一些試劑需高溫滅菌,提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。l.DNA酶抑制劑1)金屬離子螯合劑:DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活,因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑,可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2等。2)陰離子型表面活性劑:如SDS,該試劑除對核酸酶有抑制作用外,還能使蛋白質(zhì)變性,并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。2.RNA酶(RNae)抑制劑RNAase分布廣泛,極易污染樣品,而且耐髙溫、耐酸、耐堿,不宜失活。常用的RNase扣制劑有(1)皂土bentonite).作用機(jī)制:皂土帶負(fù)電荷,能吸附RNase,使其失活。②2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體,很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。作用機(jī)制:與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性使用注意①DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100~1000倍。②容易降解,保存在4℃或液氮中;③提RNA時(shí),O.%DEPC浸泡器皿37℃2h。④劇毒(3)肝素(4)復(fù)合硅酸鹽(Macaloid(5)RNase阻抑蛋白(RNasin)(6)氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)(7)胍鹽分離提取核酸的主要步驟()細(xì)胞的破碎1.高速組織搗碎機(jī)搗碎2.玻璃勻漿器勻漿3.超聲波處理法4.液氮研磨法5化學(xué)處理法SDS、吐溫80等)6.生化法(溶菌酶、纖維素酶等(二)核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開,同時(shí)避免核酸降解常用DNA提取方法:1加入10倍體積的緩沖液10mMTris-HCl(pH7.4):150mMNaCl;1OmMEDTA0.50SDSNaCl破壞核酸-蛋白質(zhì)間的靜電引力,使氫鍵破壞,核蛋白解聚;EDTA破壞細(xì)胞膜、敖合Ca2+,使DNae失活;SDS可破壞細(xì)胞膜、抑制核酸酶,還可使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來。2.加入蛋白酶K,蛋白酶K是一種非特異性蛋白酶它可將蛋白質(zhì)消化成氨基酸。一般工作濃度是50~100ug/ml反應(yīng)時(shí)間>5小時(shí),反應(yīng)溫度55°C。3.酚氯仿抽提酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果,并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大,能加速有機(jī)相與水相分層,減少殘留在水相中的酚,同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚氯仿抽提核酸提取液時(shí),需要充分混勻,為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離,再加上一定量的異戊醇(酚:氯:異戊醇=25:24:1)。使用酚時(shí)應(yīng)注意1.酚通常是透明無色的結(jié)晶,如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色,表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物,例如醌、酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn),因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。2酚具有很強(qiáng)的結(jié)合水的能力,因此在使用前需要用pH8的10mMTris-HC飽和后,加入抗氧化劑β-巰基乙醇和8羥基喹啉。3.酚腐蝕性很強(qiáng),并可引起嚴(yán)重的灼傷,操作時(shí)應(yīng)戴手套。51、天下之事常成于困約，而敗于奢靡?！懹?/p>

52、生命不等于是呼吸，生命是活動(dòng)。—