親和分離技術課件

親和分離技術親和分離技術親和分離技術1 生物親和作用由于不是整個分子或物質參與親和結合，親和作用的分子(物質)對可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-細胞，細胞-細胞。親和作用的作用力具有“鑰匙和鎖孔”的關系是產生親和結合作用的必要條件，但并不充分。除此之外，還需要分子或原子水平的各種相互作用.21 生物親和作用由于不是整個分子或物質參與親和結合，親和作用的分子(物質)對可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-細胞，細胞-細胞。親和作用的作用力具有“鑰匙和鎖孔”的關系是產生親和結合作用的必要條件，但并不充分。除此之外，還需要分子或原子水平的各種相互作用.22 親和作用的影響因素1)．離子強度

如Affinity主要源于靜電引力或氫鍵，則提高I無疑會減弱或完全破壞Affinity。 疏水性作用隨I提高而增大,因此，當Affinity作用主要源于疏水性相互作用時，增大I則可提高Affinity。 許多親和吸附的目標蛋白質可用高濃度鹽溶液洗脫，說明靜電引力在Affinity中占有重要地位。2)．pH

在親和分離操作中,溶液pH值的選擇是非常重要的.3).抑制氫鍵形成的物質 脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵配基配體的形成.因此,如果Affinity中存在氫鍵,則加入脲或鹽酸胍可減弱Affinity。但它們?yōu)閺娏易冃詣?)．溫度T T使分子和原子的熱運動，結合中心的靜電作用、氫鍵及金屬配位鍵，但可使疏水性作用。5)．大半徑的陰離子

SCN-，I-和ClO-4等半徑較大的陰離子能降低疏水相互作用。故，則這此離子會降低Affinity。6).表面活性劑/乙二醇7)．鰲合劑

如果Affinity源于親和分子對與金屬離子形成的配位鍵，則加入乙二胺四乙酸EDTA等鰲合劑除去金屬離子，可使Affinity消失。結合中心33 一般操作關鍵:?44 親和吸附介質商品化的親和吸附介質亞胺二乙酸54 親和吸附介質Home-made親和吸附介質Home-made所需材料1st

親和配基2nd

載體Home-made基本方法 親和配基+載體

=載體-親和配基天然吸附介質

如植物凝集素與糖具有親和結合作用，因此，天然瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠可直接用做外源凝集素的親和吸附介質。 例如:1st Sephadex凝膠是葡萄糖通過a-1.6結合與交聯(lián)制備的葡萄糖凝膠,可親和吸附伴刀豆球蛋白A(一種植物凝集素);2ndSepharose凝膠中含有半乳糖,在Ca2+離子存在下可親和吸附蛇毒凝集素.已介紹?65 親和配基A蛋白(proteinAorA抗原)

分子量約42kD，存在于金黃色葡萄球菌的細胞壁中，占細胞壁構成成分的約5%。

A蛋白與動物IgG具有很強的親和結合作用，每個A蛋白含有5個Fc片段結合部位。除IgG外，還與人IgG和人IgA也具有親和結合作用，但較弱。凝集素lectin

與糖特異性結合的蛋白質的總稱(酶和抗體除外)，大部分凝集素為多聚體。如。常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA,conA)與葡萄糖和甘露糖的親和結合作用較強,麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)與N-乙酰葡萄糖胺親和結合作用較強?？贵w

抗體與抗原之間具有高度特異性結合能力，結合常數(shù)一般為107~1012mol/L。因此，利用以單抗為配基的免疫和色譜法是高度純化蛋白質類生物大分子物質的有效手段。酶抑制劑 可與酶的活性部位結合,但結合后抑制酶的活性。如1st

大分子抑制劑：如胰蛋白酶有胰臟蛋白酶抑制劑PTI、卵粘蛋白(ovomucoid)和大豆胰蛋白酶抑制劑,STI)等,2nd

小分子抑制劑：如有芐脒、精氨酸和賴氨酸均可抑制胰蛋白酶的活性，并可作為親和純化胰蛋白酶的配基。75 親和配基輔酶和磷酸腺苷

脫氫酶和激酶需要在輔酶co-enzyme的存在下表現(xiàn)其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和結合作用。輔酶主要有輔酶I(NAD)、輔酶II(NADP)和ATP等。此外，AMP,ADP的腺苷部分與上述輔酶的結構類似，與脫氫和激酶同樣具有Affinity。三嗪類色素

三嗪類色素(triazinedyes)是一類分子內含有三嗪環(huán)的合成活性染料，與各種需要在NAD的存在下表現(xiàn)其生物活性的脫氫酶和激酶具有結合作用。這類結合具有抑制酶活性的作用。 三嗪類色素還與白蛋白、INF、核酸酶和糖解酶等具有很高的親和結合能力的. CibacronBlue3GA(又稱ReactiveBlue2)是最常用的活性色素過渡金屬離子

Cu2+、Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡金屬離子可與N，S和O等供電子原子產生配位鍵，因此可與蛋白質表面的組氨酸(His)的咪唑基、半胱氨酸(Cys)的巰基和色氨酸(Trp)的吲哚基發(fā)生親和作用，其中以His的咪唑基發(fā)生親和作用最強。過渡金屬離子與咪唑基的結合強弱順序是Cu2+>Ni2+>Zn2+Co2+

。肝素heparin

是存在于哺乳動物臟器中的酸性多糖類物質，M為5-30kD，具有抗凝血作用。肝素與脂肪酶、甾體受體，限制性核酸內切酶、抗凝酶、凝血蛋白質等具有親和作用.配基連接？86 配基連接溴化氰活化法固定配基：R-NH2應用：多糖凝膠的活化，適用于R-NH2型配基的修飾，如蛋白質配基IgG方法：反應在碳酸鹽buffer下進行，注意：CNBr劇毒藥品，且具有揮發(fā)性，上述操作要在通風櫥中進行 至少二人在場 急救藥品二價鐵鹽活化交連連接96 配基連接環(huán)氧基活化法

應用對象： 用于多糖凝膠和表面為氨基的載體的活化，固定分子結構為R-NH2、R-OH和R-SH的配基。步驟：1st

活化2nd

直接固化法

反應速度很慢，所需固定化時間較長(24h以上)2nd

間接固定化法環(huán)氧氯丙烷

活性環(huán)氧基

直接固化

活化：間接固定EDC106 配基連接硅膠上連接活化-氨丙基三甲氧基硅烷

環(huán)氧丙基三甲氧基硅烷

活性氨基

活性環(huán)氧基

在酸溶液中環(huán)氧基發(fā)生二醇化反應

配基連接116 配基連接金屬配位

亞胺二乙酸iminodiaceticacid,IDA配基His性質獨特:具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。因此His可與pro發(fā)生親和合作用。在鹽濃度較低的pH約等于目標pro的pI溶液中，固定化His親和作用最強，隨鹽濃度，親和作用。因此利用His為配基可分離pI相差較大的pro。

空間位阻126 配基連接間隔臂空間位阻：當較小的配基直接固定在載體下，會由于載體的空間位陰，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。辦法：在配基與載體之間連接一個“間隔臂”(spacer)。 間隔臂長度有一定限制，當間隔臂含有6~8個亞甲基(-CH2-)時親和力最大，亞甲基數(shù)超過8(長度>1.0nm)時，親和力下降。137 親和作用體系高度特異性親和體系抗原與其單克隆抗體的結合基本上是一對一的關系，即該單克隆抗體不能與其他抗原結合。群特異性親和體系外源凝素可與任何含有糖基的蛋白質結合。

148.親和膜(AM)概述隨著生物工程和生命科學的迅速發(fā)展，對生物大分子純化分離的要求越來越迫切。近年來，膜分離技術的快速發(fā)展，對生物大分子的純化分離是一個極大的推動。親和膜——將親和色譜與膜分離技術結合起來的現(xiàn)貨膜新成員。親和膜分離的基本原理：其原理與親和色譜基本相同，主要是基于欲分離物質(或稱配合物ligate)和鍵合在膜上的親和配位基(ligand)之間的生物特異相互作用，具有高度的選擇性和專一性。這種相互作用可比喻為鎖和鑰匙之間的對應關系。一個完整的親和膜包括三種具有一定聯(lián)系的物種：合適的基材、間隔臂(Spacer)和配位基。158.親和膜分離活化后的膜材料1與間隔臂分子2產生化學結合，生成帶間隔臂的膜3；間隔臂膜3與具有生物特異性的親和配位基4共價結合，生成帶配位基的親和膜5；多組分生物大分子混合物6通過親和膜時，混合物中與親和配基具有特異性相互作用的物質7與膜上的配位基產生相互作用，生成配合物質8而在膜上吸附，沒有相互作用的物質9則通過膜；選用一種能與膜上的親和配基產生相互作用的試劑10通過膜或調節(jié)體系的pH、離子強度、溫度等使形成的配合物解離而洗脫得到純化好的物質11，膜上親和配基則被頂替物質12占有；選用合適的洗滌試劑洗脫試劑分子12，使膜再生。16生物大分子在親和膜上的分離原理洗脫膜親和配位基間隔臂分子帶配位基的親和膜生物大分子混合物試劑純化的產物頂替試劑分子178.親和膜分離

親和膜的基質材料基質材料除了達到一般膜材料的要求即容易成膜，具有良好的化學和機械穩(wěn)定性外，還要求與生物活性物質具有良好的相容性和耐細菌性，更主要的要有良好的化學反應性能，以便進行活化?；|材料要求聚合物分子上含有—-OH、—NH2、—SH、—COOH等。即纖維素、聚酰胺等的聚合物?；幕罨椒ǎ轰寤璺?、雙環(huán)氧烷法、高碘酸鹽法等。188.親和膜分離

親和膜的間隔臂在分離相對分子質量很大的生物大分子時，為了克服幾何位阻障礙，往往在介質和配位基之間插入一個具有一定幾何長度的有機基團，即間隔臂（或空間臂），以使欲分離的物質方便地接近配位基上的親和位點。理想的間隔臂應有一定的長度（至少含3個原子以上），且自身不帶任何電荷，疏水性也不能太強，不帶任何附加的活性中心。常用的間隔臂是含兩個活潑氨基的二胺類物質，如乙二胺、丙二胺、己二胺、對苯二胺等；許多氨基酸和肽類物質也可作間隔臂。198.親和膜分離

親和膜的配位基由于親和分離是基于生物大分子和在基質材料上結合的配位基之間所發(fā)生的生物特異性相互作用，如酶與抑制劑或其底物，抗原與抗體等，所以，配位基的選擇和使用特別重要。通用型配位基包括外源凝集素、A蛋白、G蛋白、硼酸、輔酶、生物模擬染料、金屬螯合物等。特異性配位基包括酶和其底物或抑制劑，各種特異性免疫試劑（抗原~抗體、細胞受體~調節(jié)劑、單克隆抗體）。208.親和膜分離

親和膜的應用醫(yī)藥制劑的生產和純化。生物大分子的分離和濃縮。臨床診斷和治療酶反應機理和基因工程研究等。219親和萃取

（Affinityextraction）定義：利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行的雙水相萃取，在親和配基的親和結合作用下促進目標產物在PEG相（上相）的分配，提高目標產物的分配系數(shù)和選擇性。

PEG/Dextran,PEG/無機鹽22親和萃取純化過程

親和分配（進料），雜蛋白反萃?。ㄇ逑矗┠繕水a物反萃取（洗脫）。

239、親和反膠團萃?。ˋffinity-based

reversedmicellarextraction）

定義：指在反膠團相中除通常的表面活性劑以外，添加另一種親水頭部為親和配基的助表面活性劑（cosurfactant）；通過親和配基與目標分子的親和結合作用，促進目標產物在反膠團相的分配。24親和反膠團萃取過程25反萃取2610、親和沉淀

（Affinityprecipitation）親和沉淀:是生物親和相互作用與沉淀分離相結合的生物大分子的分離純化技術。

一次作用親和沉淀二次作用親和沉淀27一次作用親和沉淀水溶性化合物分子上偶聯(lián)有兩個或兩個以上的親和配基雙配基（bis-ligand）；多配基（polyligand）。雙配基或多配基與含有兩個以上親和結合部位的多價蛋白質產生親和交聯(lián)，增大為較大的交聯(lián)網絡而沉淀。28二次作用親和沉淀

制備親和沉淀介質:利用在物理場改變時溶解度下降、發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基。親和介質結合目標分子后，通過改變物理場使介質與目標分子共同沉淀的方法稱為二次作用親和沉淀。

離心或過濾回收沉淀，即可除去未沉淀的雜蛋白。沉淀清洗后加入洗脫劑即可純化目標產物。29可逆沉淀性聚合物

—聚丙烯酰胺30可逆沉淀性聚合物——

聚合脂質體（polymerizedliposome,PLS）

31親和沉淀純化技術優(yōu)點

（1）溶液中進行，無擴散傳質阻力，親和結合速度快；（2）親和配基裸露在溶液中，配基利用率高；（3）離心或過濾技術回收沉淀，規(guī)模放大；（4）可用于高粘度或含微粒料液中目標產物純化。3210.4分子印跡技術----原理介紹分子印跡技術（MIT）的起源Pauling鎖匙理論（理論基礎）Dickey專一性吸附（萌芽）Wulff首次合成（形成標志）Mosbach茶堿分子印跡聚合物（發(fā)展）LundUniversity成立分子印跡學會（SocietyforMolecularImprinting，SMI）34分子印跡技術的基本原理分子印跡技術是指制備對某一特定的目標分子(模板分子、印跡分子或烙印分子)具特異選擇性的聚合物技術。

三大特點：構效預訂性