線粒體功能及其相關(guān)毒性作用培訓課件

線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體內(nèi)膜內(nèi)膜具有很高的蛋白質(zhì)/脂質(zhì)比，缺乏膽固醇，富含心磷脂。內(nèi)膜具有極高的不透性，因此限制了所有分子和離子的自由通過，是質(zhì)子電化學梯度的建立以及ATP合成所必須的。線粒體內(nèi)膜上的蛋白主要執(zhí)行三種功能：1）電子傳遞鏈；2）ATP合成；3）轉(zhuǎn)運蛋白。2線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體膜間隙膜間隙的寬度通常為6-8nm，在呼吸活躍時，膜間隙可顯著擴大。含有可溶性酶類、底物以及輔助因子。其含有的腺苷酸激酶可以催化ATP分子末端磷酸基團轉(zhuǎn)移到AMP，生成ADP。線粒體基質(zhì)線粒體基質(zhì)富含可溶性蛋白膠狀物，具有穩(wěn)定的pH和滲透壓。具有催化三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化和氨基酸降解的相關(guān)酶類。含有DNA、RNA、核糖體。3線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體的分離外膜磷脂合成脂肪酸的去飽和化脂肪酸鏈的延伸標志酶：單胺氧化酶內(nèi)膜電子傳遞氧化磷酸化代謝中間物的轉(zhuǎn)運標志酶：細胞色素氧化酶基質(zhì)丙酮酸氧化三羧酸循環(huán)脂肪酸的β氧化DNA復制、RNA轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)翻譯標志酶：蘋果酸脫氫酶膜間空間核苷酸的磷酸化標志酶：腺苷激酶4線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體產(chǎn)能（ATP）示意圖5線粒體功能及其相關(guān)毒性作用6糖丙酮酸脂肪脂肪酸CoA三羧酸循環(huán)TCANADH或FADH2電子傳遞到氧生成水形成質(zhì)子電化學梯度ATP合成酶合成ATP線粒體內(nèi)膜丙酮酸載體6線粒體功能及其相關(guān)毒性作用

線粒體是糖類、脂類和蛋白質(zhì)最終氧化釋能的場所，TCA是物質(zhì)氧化的最終共同途徑，氧化磷酸化是生物體獲得能量的主要途徑。（一）線粒體中的氧化代謝7線粒體功能及其相關(guān)毒性作用在電子傳遞的過程中，接受和釋放的電子的分子和原子被稱為電子載體。由電子載體組成的電子傳遞序列被稱為電子傳遞鏈。五種類型電子載體：黃素蛋白、細胞色素、泛醌、鐵硫蛋白和銅原子。除泛醌外，其他氧化還原中心都是與蛋白質(zhì)相連的輔基。呼吸鏈中的電子載體有嚴格的排列順序和方向，按氧化還原電位由低向高排列(NAD+/NADH最低，O2/H2O最高）。（二）電子傳遞鏈與電子傳遞8線粒體功能及其相關(guān)毒性作用99線粒體功能及其相關(guān)毒性作用電子傳遞復合物，組成兩種呼吸鏈：NADH呼吸鏈,FADH2呼吸鏈，電子傳遞鏈各組分在線粒體內(nèi)膜上不對稱分布。電子傳遞復合物10線粒體功能及其相關(guān)毒性作用復合物Ⅰ：NADH-CoQ還原酶（既是電子傳遞體又是質(zhì)子移位體）組成：含42個蛋白亞基，至少6個Fe-S中心和1個黃素蛋白。作用：催化1對電子從NADH輔酶Q；泵出4H+復合物Ⅱ：琥珀酸-CoQ還原酶（是電子傳遞體而非質(zhì)子移位體）組成：含F(xiàn)AD輔基，2Fe-S中心，作用：催化1對低能電子FADFe-S輔酶Q(無H+泵出)復合物Ⅲ：CoQ-Cytc還原酶（既是電子傳遞體又是質(zhì)子移位體）

組成：包括1個cytc1、1個cytb、1個Fe-S蛋白作用：催化電子從UQH2cytc；泵出4H+（2個來自UQ，2個來自基質(zhì)）復合物Ⅳ：細胞色素c氧化酶（既是電子傳遞體又是質(zhì)子移位體）組成：二聚體，每一單體含13個亞基，三維構(gòu)象，cyta,cyta3,Cu,Fe作用：催化電子從cytc分子O2形成水，2H+泵出，2H+參與形成水11線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體承擔的能量轉(zhuǎn)換實質(zhì)上就是把H+跨膜電位差和質(zhì)子濃度梯度形成的質(zhì)子驅(qū)動力轉(zhuǎn)換成ATP分子中的高能磷酸鍵。TCA循環(huán)提供的質(zhì)子驅(qū)動力和高能電子是線粒體合成ATP的基本能源。（三）質(zhì)子轉(zhuǎn)移與驅(qū)動力的形成Ca2+調(diào)控12線粒體功能及其相關(guān)毒性作用13線粒體功能及其相關(guān)毒性作用氧化(電子傳遞、放能)與磷酸化(ADP+Pi，儲能)同時進行，密切耦聯(lián)，分別由兩個不同的結(jié)構(gòu)體系實現(xiàn)。用超聲波將線粒體破碎，線粒體內(nèi)膜碎片可自然卷成顆粒朝外的小膜泡，這種小膜泡稱為亞線粒體小泡或亞線粒體顆粒。（四）ATP形成機制—氧化磷酸化ATP合酶的結(jié)構(gòu)與組成ATP合酶是最終生成ATP的裝置。它分布于細菌質(zhì)膜、線粒體內(nèi)膜和葉綠體類囊體膜上。ATP合酶的分子由球形的頭部和基部組成。14線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體主要功能是高效地將有機物中儲存的能量轉(zhuǎn)換為細胞生命活動的直接能源ATP；與細胞中氧自由基的生成，調(diào)節(jié)細胞氧化還原電位和信號轉(zhuǎn)導、調(diào)控細胞凋亡、細胞內(nèi)多種離子的跨膜轉(zhuǎn)運及電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡。線粒體功能小結(jié)15線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體的損傷線粒體滲透轉(zhuǎn)變細胞內(nèi)Ca2+異常ATP合成酶異常自由基的產(chǎn)生和積累原發(fā)性代謝紊亂的相互作用線粒體DNA異常16線粒體功能及其相關(guān)毒性作用在動物細胞線粒體膜上存在滲透性轉(zhuǎn)換孔（PTP），當PTP開放時，線粒體內(nèi)膜對中低分子量的化合物的滲透性會突然增加，從而導致線粒體基質(zhì)中分子量小于1.5kD的游離物質(zhì)滲透進入膜間空間，這個過程稱為線粒體滲透性轉(zhuǎn)換（mitochondrionpermeabilitytransition,MPT）。18線粒體功能及其相關(guān)毒性作用細胞內(nèi)的鈣庫細胞內(nèi)儲存Ca2+庫包括肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體，負責肌細胞細胞質(zhì)中鈣離子的調(diào)節(jié)，心肌細胞去極化時釋放鈣離子，復極化時攝取鈣離子。心衰時，肌質(zhì)網(wǎng)功能障礙的原因之一是能量的缺乏，ATP依賴的Ca2+泵功能降低，導致心肌復極化時不能有效攝取鈣離子，去極化時又不能及時釋放鈣離子。線粒體在正常情況下可以攝取細胞總Ca2+量的20%，這與線粒體中生物氧化酶的功能有關(guān)，在心衰出現(xiàn)時，細胞內(nèi)pH的改變影響線粒體內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，使線粒體攝取鈣離子增多，當Ca2+超載時，引起線粒體功能障礙。1919線粒體功能及其相關(guān)毒性作用Ca2+濃度的持續(xù)升高高血壓：Ca2+釋放的增加使更多的鈣離子進入平滑肌細胞，同時還促進了細胞內(nèi)儲存Ca2+的釋放，細胞內(nèi)儲存鈣的釋放再加上細胞外鈣離子的內(nèi)流可引起血管平滑肌的收縮，且影響細胞的生長，造成血管肥大，導致結(jié)構(gòu)性和功能性外周阻力增高，血壓增高。帕金森?。涸谡Ｇ闆r下，神經(jīng)元中持久的鈣離子信號轉(zhuǎn)到的影響是受到線粒體Ca2+釋放和累積的調(diào)節(jié)，定位于線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈蛋白復合體，從線粒體機制排出質(zhì)子，產(chǎn)生一個150v-180mv（內(nèi)側(cè)負）的線粒體膜電位，這個電化學梯度驅(qū)動了ATP的合成并且提供了Ca2+在線粒體內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)運。在PD病人中，線粒體功能異常使鈣離子超載，導致多巴胺神經(jīng)元更加興奮。20線粒體功能及其相關(guān)毒性作用ATP合酶的工作特點：可逆性復合酶ATP耗竭主要的能量物質(zhì)，參與生物合成以及磷酸化、肌肉收縮、細胞骨架聚合、細胞運動、細胞分裂、膜泡轉(zhuǎn)運。質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵、溶酶體膜質(zhì)子泵等多種離子泵功能失常。線粒體功能的異常：氧化磷酸化過程受到損害，ADP堆積，ATP耗竭，細胞內(nèi)酸中毒、離子堆積，細胞容量調(diào)節(jié)失控，最終導致細胞膜的不可逆損傷。21線粒體功能及其相關(guān)毒性作用自由基的產(chǎn)生自由基：自由基是指能夠獨立存在的具有一個或者多個不配對電子的任何核素（原子、原子團、分子，species），具有很高的化學活性。在生物體中最重要的自由基是活性氧（ROS,reactivexoxygenspecies），尤其是超氧陰離子（O2-）和羥自由基（OH.）以及分子氧，自由基極易給出電子或者俘獲電子。分類：①可以分為氧自由基和脂自由基。②從活性氧角度可以分成氧自由基、過氧化物（過氧化氫、氫過氧化物）、激發(fā)態(tài)氧。2222線粒體功能及其相關(guān)毒性作用自由基的產(chǎn)生線粒體：是氧自由基生成的主要場所之一，作為線粒體正常代謝的副產(chǎn)品，自由基在線粒體內(nèi)會不斷積累產(chǎn)生。在氧化磷酸化的過程中，有1%-5%的氧會逃離正常的細胞色素氧化酶催化過程，經(jīng)過非催化形式，逐步的非共價還原形成自由基，主要是超氧陰離子和過氧化氫，在線粒體呼吸鏈中，還原性的CoQ、黃素蛋白、細胞色素C等均可產(chǎn)生超氧陰離子。2323線粒體功能及其相關(guān)毒性作用自由基的正常功能代謝儲能：體內(nèi)約17%的自由基是在氧代謝的過程中產(chǎn)生的。如ATP合成。轉(zhuǎn)化排泄：體內(nèi)代謝產(chǎn)物、外源性的藥物及毒物從體內(nèi)清除是，均需在加單氧酶系作用下經(jīng)過羥化反應(yīng)，經(jīng)尿或者膽汁排出。防御殺菌和抗腫瘤：吞噬細胞在吞噬活動中被激活，耗氧量增加顯著，即所謂呼吸爆發(fā)。所攝取的氧大部分產(chǎn)生過氧化氫、超氧陰離子以殺滅微生物、寄生蟲并且可以破壞癌細胞，進一步氧化，可以消化被吞噬的異物。阿霉素通過轉(zhuǎn)化形成自由基破壞癌細胞DNA（同時損傷正常細胞）。2424線粒體功能及其相關(guān)毒性作用自由基損害作用對脂類的作用：生物膜中的不飽和脂肪酸受到自由基的作用而轉(zhuǎn)變成過氧化脂質(zhì)，從而導致膜的流動性改變，膜流動性下降導致細胞脆性增加、膜受體、離子通道異常，變形能力下降，出現(xiàn)動脈粥樣硬化等，同樣線粒體膜和溶酶體膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)也會出現(xiàn)相同的后果，并且脂質(zhì)過氧化會誘發(fā)新的自由基的產(chǎn)生。對蛋白質(zhì)的作用：會造成蛋白質(zhì)的交聯(lián)、聚合和肽鏈的斷裂，也可以使蛋白質(zhì)和脂類結(jié)合形成聚合物，是蛋白質(zhì)喪失功能。2525線粒體功能及其相關(guān)毒性作用自由基損害作用對核酸的作用：自由基作用于DNA，與堿基發(fā)生加成反應(yīng)，造成對堿基的修飾，從而引起基因突變；也可以引起DNA鏈的斷裂，以及染色體畸變和染色體斷裂。對細胞外基質(zhì)的破壞：氧自由基可以使細胞外基質(zhì)中膠原纖維的膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)，使透明質(zhì)酸降解，從而引起基質(zhì)變得疏松，彈性下降，出現(xiàn)皺紋。心肌缺血再灌注：狗冠狀動脈結(jié)扎-突然松開恢復灌流-室顫死亡。缺血為自由基的形成提供了有利條件，再灌流則像是加入了催化劑使自由基瞬時大量生成。應(yīng)預先給予自由基清除劑。2626線粒體功能及其相關(guān)毒性作用三種原發(fā)性代謝紊亂的相互作用促進產(chǎn)生ROS/RNS27線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體的損傷在醫(yī)學上，由線粒體功能障礙引起的疾病稱為線粒體病。線粒體疾病都為母系遺傳。外界環(huán)境因素對線粒體功能的影響：克山病。細胞中線粒體的數(shù)量隨年齡增長而減少，而體積卻隨年齡增長而增大。人類線粒體疾病其原發(fā)機制都是mtDNA異常（突變、缺失、重排）引起的遺傳性疾病，表現(xiàn)為電子傳遞酶系和氧化磷酸化酶系的異常。誘導因素之一為氧自由基，機體衰老即退行性疾病時，Mn-SOD活性降低，氧自由基就積累在線粒體中，從而導致多種疾病的發(fā)生。氧自由基造成mtDNA氧化損傷的積累量可比核DNA高16倍，同時mtDNA不具有核基因的修復裝置，因此mtDNA發(fā)生突變的頻率比細胞核高10倍以上。28線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體損傷的檢測線粒體膜勢能檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。

29線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體膜勢能的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探?？梢詸z測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。30線粒體功能及其相關(guān)毒性作用線粒體膜勢能的檢測JC-1單體的最大激發(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為590nm。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。通?？梢訡CCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-