色譜分析導(dǎo)論課件

提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析抗壞血酸的生物活性

L(100%)D(無(wú))L異(無(wú))D異(5%)1方法原理LD異1.1混合組分的別離AE03-B萃取器1方法原理多級(jí)串聯(lián)離心萃取機(jī)〔實(shí)現(xiàn)多級(jí)串聯(lián)逆流洗滌或萃取〕1方法原理1.2色譜別離1903年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特別離植物色素1方法原理混合色素CaCO3石油醚綠色層(葉綠素A）黃色層（葉黃素）黃色層(胡蘿卜素)洗出液1.2.1色譜別離原理P111

固定相:將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相〔固體或液體〕；流動(dòng)相:自上而下運(yùn)動(dòng)的一相〔氣體或液體〕；色譜柱:裝有固定相的管子〔玻璃管或不銹鋼管〕。1方法原理當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，會(huì)與固定相發(fā)生作用;

由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異;

在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，

各組分按先后不同的次序從固定相中流出。1方法原理1.2.2色譜法的分類

氣相色譜(GC):氣體為流動(dòng)相的色譜分析方法氣固色譜(GSC)氣液色譜(GLC)液相色譜(LC):液體為流動(dòng)相的色譜分析方法液固色譜〔LSC〕液液色譜(LLC)超臨界流體色譜(SFC):流動(dòng)相的色譜分析方法1方法原理1方法原理流動(dòng)相氣體液體方法名稱氣相色譜液相色譜固定相固體吸附劑液體固體吸附劑液體方法名稱氣-固色譜氣-液色譜液-固色譜液-液色譜1.3色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語(yǔ)P1221.3.1基線

在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒(méi)有樣品組分流出時(shí)的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線，但實(shí)際中存在漂移。1方法原理

1.3.2色譜流出曲線1方法原理色譜峰峰高:色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離峰面積:組分的流出曲線與基線所包圍的面積定量分析的主要依據(jù)

1方法原理標(biāo)準(zhǔn)偏差

對(duì)應(yīng)0.607峰高的一半峰寬值半峰寬W1/2

對(duì)應(yīng)0.5峰高的寬值

W1/2=2.354

峰底寬度WW=4

1方法原理

死時(shí)間tM/死體積VM

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積。

1方法原理信號(hào)tM進(jìn)樣保存時(shí)間tR/保存體積VRP123試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間或流出的體積。1方法原理信號(hào)進(jìn)樣tR1.3.6調(diào)整保存時(shí)間tR//調(diào)整保存體積VR/某組分的保存時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的調(diào)整保存時(shí)間或流出的體積。tR′=tRtMVR′=VRVM1方法原理信號(hào)進(jìn)樣tR/分配系數(shù)KP124分配色譜的別離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)屢次的分配過(guò)程，而吸附色譜的別離是基于反復(fù)屢次的吸附-脫附過(guò)程。1方法原理1.3.8分配比kP124

分配比又稱容量因子，指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。1方法原理分配系數(shù)K與分配比k的關(guān)系

K=k.

相比率(β)反映各種色譜柱柱型特點(diǎn)的一個(gè)重要參數(shù)。填充柱，β值一般為6~35

毛細(xì)管柱，β值為60~6001方法原理色譜流出曲線的用途從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；根據(jù)色譜峰的保存值，可以進(jìn)行定性分析；根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；色譜峰的保存值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)；色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相〔或流動(dòng)相〕選擇是否適宜的依據(jù)。1方法原理提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析2.1塔板理論P(yáng)124

把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡(jiǎn)稱板高。

2色譜別離理論在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快到達(dá)分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前移動(dòng)。對(duì)于一根長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)：n=L/Hn:理論塔板數(shù)與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。2色譜別離理論塔板理論指出：當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50時(shí)，可得到根本對(duì)稱的峰形曲線。在色譜柱中，n值一般很大，如氣相色譜柱的n約為103~106，因而流出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。(2)當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過(guò)反復(fù)屢次的分配平衡后，仍可獲得良好的別離。2色譜別離理論n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式：n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2在tR一定時(shí)，如果色譜峰很窄，那么說(shuō)明n越大，H越小，柱效能越高。實(shí)際上反映色譜柱的別離效能:n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2H有效=L/n有效2色譜別離理論例題1：某組分峰的峰底寬為40s，保存時(shí)間為400s，死時(shí)間為20s,計(jì)算此色譜柱的理論塔板數(shù)。解：n=16(tR/W)2=16(400/40)2=1600(塊)n有效=16(tR/W)2=16(380/40)2=1444(塊)2色譜別離理論2.2速率理論1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter〔范第姆特〕等在研究氣液色譜時(shí)，提出了色譜過(guò)程動(dòng)力學(xué)理論—速率理論。它吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過(guò)程，在動(dòng)力學(xué)根底上較好地解釋了影響板高的各種因素。理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。2色譜別離理論速率理論的數(shù)學(xué)簡(jiǎn)化式P125

H=A+B/u+Cu

A:渦流擴(kuò)散項(xiàng)〔多路效應(yīng)項(xiàng)〕B/u:分子擴(kuò)散項(xiàng)〔縱向擴(kuò)散項(xiàng)〕Cu:傳質(zhì)阻力項(xiàng)2色譜別離理論①渦流擴(kuò)散項(xiàng)AP125當(dāng)組分在填充色譜柱中隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似渦流的流動(dòng)。填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長(zhǎng)短不一，同時(shí)進(jìn)色譜柱的相同組分到達(dá)柱口時(shí)間并不一致，引起了色譜峰的變寬。2色譜別離理論氣相色譜中渦流擴(kuò)散引起的峰形擴(kuò)展2色譜別離理論液相色譜中渦流擴(kuò)散引起的峰形擴(kuò)展2色譜別離理論色譜峰變寬的程度：A=2λdPA與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)那么因子λ有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無(wú)關(guān)。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對(duì)于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散,A=0。2色譜別離理論②分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u〔縱向擴(kuò)散項(xiàng)〕P126由濃度梯度造成的分子擴(kuò)散。組分從柱入口參加，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子〞狀。它隨著流動(dòng)相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子〞必然自發(fā)的向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)B=2γDgγ是填充柱內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。2色譜別離理論縱向分子擴(kuò)散使峰展寬〔a〕柱內(nèi)譜帶構(gòu)型〔b〕相應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)2色譜別離理論（a）（b）液相色譜中分子擴(kuò)散引起的峰形擴(kuò)展2色譜別離理論③傳質(zhì)阻力項(xiàng)CuP126

氣相色譜以氣體為流動(dòng)相，液相色譜以液體為流動(dòng)相，傳質(zhì)過(guò)程不完全相同。氣液色譜傳質(zhì)阻力系數(shù)C：氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg液相傳質(zhì)阻力系數(shù)CL

C=Cg+CL

傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu＝Cgu+CLu2色譜別離理論2.2.2液相色譜速率方程

H=HE+HL+HS+HMM

=A+B/u+Cu

HE=A

：渦流擴(kuò)散項(xiàng)

HL＝B/u：分子擴(kuò)散項(xiàng)

Cu

＝HS+HMM

：傳質(zhì)阻力項(xiàng)

HS

：固定項(xiàng)的傳質(zhì)阻力項(xiàng)

HMM

：流動(dòng)項(xiàng)的傳質(zhì)阻力項(xiàng)

2色譜別離理論在液液分配色譜中，傳質(zhì)阻力系數(shù)〔C〕包含固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)〔Cs〕和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)〔Cm〕：C=Cs＋Cm2色譜別離理論①固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)〔Cs〕2色譜別離理論液體流動(dòng)相進(jìn)樣后起峰形溶解在固定液表面溶質(zhì)分子達(dá)到峰的前沿樣品移出色譜柱時(shí)的峰形溶解在固定液內(nèi)部溶質(zhì)分子達(dá)到峰的后尾固定液

②流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm

流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力：mmdp2/Dm

滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力：smdp2/Dm

Cm=mmdp2/Dm+smdp2/Dm2色譜別離理論移動(dòng)流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力2色譜別離理論進(jìn)樣后的峰形移動(dòng)流動(dòng)相在固體顆粒間構(gòu)成的層流樣品移出色譜柱時(shí)峰形固定相基體固定相基體滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力2色譜別離理論固體相基體進(jìn)樣后的峰形

滯留流動(dòng)相固定液膜樣品移出色譜柱時(shí)峰形2.3別離效能指標(biāo)P127

色譜柱的總別離效能指標(biāo)—?jiǎng)e離度(R)別離度是一個(gè)綜合性指標(biāo)。別離度是既能反映柱效率,又能反映選擇性的指標(biāo)，稱總別離效能指標(biāo)。

R<1，兩峰有局部重疊；R=1，別離程度可達(dá)98%；R=1.5，別離程度可達(dá)99.7%,作為相鄰兩組分已完全別離的標(biāo)志。2色譜別離理論2.3.2影響別離度的主要因素P128別離度與柱效的關(guān)系別離度與理論塔板數(shù)的關(guān)系還受熱力學(xué)性質(zhì)的影響。固定相確定，被別離物質(zhì)對(duì)的別離度將取決于n：

(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2

增加色譜柱的長(zhǎng)度可以提高別離度，但延長(zhǎng)分析時(shí)間。提高別離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過(guò)降低板高，以提高別離度。2色譜別離理論例題2：物質(zhì)A和B在一根30.00cm長(zhǎng)的柱上的保存時(shí)間分別為16.40min和17.63min。不被保存組分通過(guò)該柱的時(shí)間為1.30min。峰底寬度分別為1.11min和1.21min。試計(jì)算：〔1〕柱的別離度〔2〕柱的平均塔板數(shù)〔3〕到達(dá)完全別離所需的柱長(zhǎng)度2色譜別離理論解:〔1〕柱的別離度R=2(tR2-tR1)/〔W1+W2〕R=2(17.63-16.4)/(1.11+1.21)=1.06〔2〕柱的平均塔板數(shù)n=16(tR/W)2n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2=3397n平均=〔3493+3397)/2=34452色譜別離理論〔3〕到達(dá)完全別離，R≥1.5所需的柱長(zhǎng)度(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2解1：(1.06/1.5)2=30.0/L2L2=60cm解2：n2=3445(1.5/1.06)2=6898L2=n×H=6898(30.0/3445)=60cm2色譜別離理論

2.2.2對(duì)板高的影響因素(1)流動(dòng)相線速度對(duì)板高的影響P131LC和GC的H—u圖相似對(duì)應(yīng)某一流速都有一個(gè)板高的極小值;

極小值就是柱效最高點(diǎn)。

LC板高極小值比GC的極小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，說(shuō)明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多。2色譜別離理論(2)分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)板高的影響較低線速時(shí)，分子擴(kuò)散項(xiàng)起主要作用較高線速時(shí)，傳質(zhì)阻力項(xiàng)起主要作用高線速度時(shí)，固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)成為影響板高的主要因素，隨著速度增高，板高值越來(lái)越大，柱效急劇下降；流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)板高的奉獻(xiàn)幾乎是一個(gè)定值。2色譜別離理論(3)固定相粒度大小對(duì)板高的影響

粒度越細(xì)，板高越小，受線速度影響亦小，這是HPLC中采用細(xì)顆粒作固定相的根據(jù)。固定相顆粒愈細(xì)，柱流速愈慢。只有采取高壓技術(shù)，流動(dòng)相流速才能符合實(shí)驗(yàn)要求。2色譜別離理論提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析3.1色譜的定性分析P133各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保存值，可作為一種定性指標(biāo)。目前色譜定性方法都是基于保存值。但是不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保存值，即保存值并非專屬的。因此僅根據(jù)保存值對(duì)一個(gè)完全未知的樣品定性是困難的。在了解樣品的來(lái)源、性質(zhì)、分析目的的根底上，對(duì)樣品組成作初步的判斷，結(jié)合以下的方法那么可確定色譜峰所代表的化合物。3色譜定性定量分析保存指數(shù)法又稱為柯瓦〔Kováts〕指數(shù)，它表示物質(zhì)在固定液上的保存行為，是目前使用最廣泛并被國(guó)際上公認(rèn)的定性指標(biāo)。

具有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)。保存指數(shù)是把正構(gòu)烷烴中某兩個(gè)組分的調(diào)整保存值的對(duì)數(shù)作為相對(duì)的尺度，并假定正構(gòu)烷烴的保存指數(shù)為n100。被測(cè)物的保存指數(shù)值可用內(nèi)插法計(jì)算。3色譜定性定量分析

3色譜定性定量分析保存指數(shù)的意義：與被測(cè)物質(zhì)具有相同調(diào)整保存時(shí)間的假想的正構(gòu)烷烴的碳數(shù)乘以100；保存指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實(shí)驗(yàn)條件無(wú)關(guān)；其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好。只要柱溫與固定相相同，就可用文獻(xiàn)值進(jìn)行鑒定，而不必用純物質(zhì)相對(duì)照。3色譜定性定量分析3.2色譜定量分析P1333.2.1定量依據(jù)當(dāng)操作條件一致時(shí)，被測(cè)組分的質(zhì)量(或濃度)與檢測(cè)器給出的響應(yīng)信號(hào)成正比。即：

mi=fi×Aimi=fi×hi

式中mi為被測(cè)組分i的質(zhì)量；Ai為被測(cè)組分i的峰面積；

fi為被測(cè)組分i的校正因子。3色譜定性定量分析色譜定量分析的過(guò)程準(zhǔn)確測(cè)量檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)—峰面積或峰高；準(zhǔn)確求得比例常數(shù)—校正因子；正確選擇適宜的定量計(jì)算方法，將測(cè)得的峰面積或峰高換算為組分的百分含量。3色譜定性定量分析3.2.3峰面積的測(cè)量對(duì)稱形峰面積的測(cè)量—峰高乘以半峰寬法

A=1.065hW1/2(2)不對(duì)稱形峰面積的測(cè)量—峰高乘平均峰寬法不對(duì)稱峰的測(cè)量采用峰高乘以半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。

A=h×(W0.15+W0.85)/23色譜定性定量分析3.2.4定量校正因子峰面積的大小不僅取決于組分的質(zhì)量，而且還與它的性質(zhì)有關(guān)。兩個(gè)質(zhì)量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所得的峰面積卻不相同。因此，混合物中某一組分的百分含量并不等于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所占的百分率。不能直接利用峰面積計(jì)算物質(zhì)的含量。為了使峰面積能真實(shí)反映出物質(zhì)的質(zhì)量，就要對(duì)峰面積進(jìn)行校正，需要引入校正因子。3色譜定性定量分析絕對(duì)校正因子：fi=mi/Aifi值與組分i的質(zhì)量絕對(duì)值成正比，所以稱為絕對(duì)校正因子。在定量分析時(shí)要精確求出fi值是比較困難：精確測(cè)量絕對(duì)進(jìn)樣量困難；峰面積與色譜條件有關(guān)，要保持測(cè)定fi值時(shí)的色譜條件相同，既不可能又不方便；即便能夠得到準(zhǔn)確的fi值，也由于沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)而無(wú)法直接應(yīng)用。3色譜定性定量分析(2)相對(duì)校正因子①相對(duì)校正因子的定義

fi=fi/fs

即某組分i的相對(duì)校正因子fi為組分i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的絕對(duì)校正因子之比。

fi=(mi/Ai)/(ms/As)=(mi/ms).(As/Ai)3色譜定性定量分析②相對(duì)校正因子的測(cè)定方法相對(duì)校正因子值只與被測(cè)物和標(biāo)準(zhǔn)物以及檢測(cè)器的類型有關(guān)，而與操作條件無(wú)關(guān)。因此，fi值可自文獻(xiàn)中查出引用。文獻(xiàn)中查不到所需的fi值，也可以自己測(cè)定。常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯：熱導(dǎo)檢測(cè)器〔TCD〕正庚烷：氫焰檢測(cè)器〔FID〕測(cè)定相對(duì)校正因子最好是用色譜純?cè)噭?。假設(shè)無(wú)純品，也要確知該物質(zhì)的百分含量。測(cè)定時(shí)首先準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)物，然后將它們混合均勻進(jìn)樣，分別測(cè)出其峰面積，再進(jìn)行計(jì)算。3色譜定性定量分析定量分析方法P135

歸一化法

把所有出峰組分的含量之和按100%計(jì)的定量方法稱為歸一化法。其計(jì)算公式如下：

3色譜定性定量分析歸一化法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，操作條件變化時(shí)對(duì)定量結(jié)果影響不大。在實(shí)際工作中仍有一些限制:

樣品的所有組分必須全部流出，且出峰。某些不需要定量的組分也必須測(cè)出其峰面積及fi

值；測(cè)量低含量尤其是微量雜質(zhì)時(shí)，誤差較大。3色譜定性定量分析例題3：在一個(gè)苯系混合物液中，用氣相色譜法分析，獲得如下數(shù)據(jù)，計(jì)算各組分的含量。3色譜定性定量分析組分苯甲苯鄰二甲苯對(duì)二甲苯間二甲苯fi0.7800.7940.8400.8120.801h/cm4.203.067.502.981.67W1/2/cm0.150.160.170.180.19解：P苯=1.065×

0.780×4.20×0.15=0.523A=1.065×0.780×4.20×0.15+1.065×0.794×

3.06×0.16+1.