基因組學(xué)-教學(xué)課件-4基因組測(cè)序與序列組裝2

基因組測(cè)序與序列組裝基因組測(cè)序與序列組裝基因組計(jì)劃的最終目標(biāo)是獲得所研究的生物的完整的DNA順序。最佳狀況是將物理圖譜和遺傳圖譜進(jìn)行有機(jī)整合,以確定基因以及其他重要的序列在DNA順序中的位置主要內(nèi)容1.DNA測(cè)序的方法2DNA序列的組裝3.基因組測(cè)序的其他路線4.人類基因組的測(cè)序和組裝4.1DNA測(cè)序的方法DNA測(cè)序技術(shù)主要有兩種方法,都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的。A.雙脫氧鏈終止法(thechainterminationmethod),是通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈來讀取待測(cè)DNA分子的順序。B.化學(xué)降解法(chemicaldegradationmethod),是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理,產(chǎn)生切口,用同位素標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序A.雙脫氧鏈終止法原理DNA復(fù)制模板DNA、DNA聚合酶、引物、4種dNTP政(的加在反廢愛統(tǒng)雙知3(基)核就三止延伸,鏈端摻入單脫氧核苷酸的片段可繼續(xù)延如此得到3端終止于ddNTP的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段4個(gè)反應(yīng)體系中分別加入4種不同的ddNTP,濃度低于dNTP。反應(yīng)終止后,分四個(gè)泳道進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠),分離長(zhǎng)短不一的核酸片段(長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基),根據(jù)片段3'端的雙脫氧堿基,可依次閱讀合成片段的堿基排列順序A.雙脫氧鏈終止法TAAGCTCGACTdotp,dGTP.dATP.dTTHdETPGATESGAGITddtCUdaGAddA.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法對(duì)DNA多聚酶的要求高酶活性無5’一3·外切核酸酶活性,5’一3’外切核酸酶使DNA聚合酶去除已存在的鏈無3’-5’外切核酸酶活性,3-5外切核酸酶使DNA聚合酶校正自身錯(cuò)誤天然的DNA聚合酶不能滿足,需要進(jìn)行改造Klenow聚合酶:來自大腸桿菌DNA聚合酶I,外切酶活性去除,酶活性不夠,250bp測(cè)序酶Sequenase:噬菌體T7編碼A.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法要求單鏈作為模板:將DNA克隆到質(zhì)粒載體中:堿變性或熱變性變?yōu)閱捂滊p向測(cè)序;污染,干擾以M13載體克隆單鏈DNA:無需變性,直接測(cè)序3kb,擴(kuò)增時(shí)容易發(fā)生丟失與重排,小片段DNA測(cè)序以噬菌粒(phagemid)克隆DNA:改造的質(zhì)粒載體2個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)(質(zhì)粒自身和M13單鏈?zhǔn)删w在大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生單鏈?zhǔn)删?>10kbdnA測(cè)序PcR產(chǎn)生單鏈DNA中英聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室模板DNA工基正常引物攜帶金屬粒引物PCR自血郵□_■可r-hn吸磁法收集擴(kuò)增引物A.雙脫氧鏈終止法通過M13載體獲得單鏈DNA以測(cè)序DM距入H段是利用M13噬菌體在式齡菌體外能以單鏈形式存在。將待測(cè)序DNA片段連接到M13載體中去再利用引物,進(jìn)行DNA合成,并在合成系統(tǒng)中加入dNTPA.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法中引物的影響:引物決定了模板鏈的測(cè)序起點(diǎn),一般來說,是采用克隆位點(diǎn)附近載體上的一段順序載體DNAA通用引物:與載體DNA中附近插