經(jīng)典液相色譜法-課件

Chap.5經(jīng)典液相色譜法

1ppt課件本章內(nèi)容層次掌握：吸附色譜法、分配色譜法的基本原理以及應(yīng)用，薄層色譜法的基本操作。熟悉：離子交換色譜法的基本原理以及應(yīng)用。了解：尺寸排阻色譜法、聚酰胺色譜法的基本原理以及應(yīng)用。2ppt課件§1吸附色譜法1.

基本原理1.1定義一種溶質(zhì)基于吸附現(xiàn)象而獲得分離的液－固色譜分析方法，按操作方式又可分為吸附柱色譜和薄層色譜。3ppt課件1.2吸附色譜法的依據(jù)吸附過(guò)程的兩個(gè)規(guī)律：1）吸附過(guò)程是可逆的，存在著吸附解附的動(dòng)態(tài)平衡,存在一個(gè)吸附平衡常數(shù)

K=Cs/Cm2）吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附行為有差異4ppt課件吸附機(jī)理流動(dòng)相通過(guò)固定相時(shí)，吸附劑表面的活性中心吸附流動(dòng)相分子，當(dāng)組分分子進(jìn)入柱子時(shí)，會(huì)趕走流動(dòng)相分子而占據(jù)吸附劑的活性中心位，即組分被吸附；反之，溶劑分子也可把溶質(zhì)分子趕走，即解吸。5ppt課件

1.3吸附等溫線(xiàn)

指在一定溫度下，某一組分在固定相和流動(dòng)相之間達(dá)到平衡時(shí)，組分在固定相中的濃度Cs對(duì)組分在流動(dòng)相中的濃度Cm作圖得到的曲線(xiàn)，用函數(shù)描述為Cs=f（Cm），它描述了組分在兩相中濃度之間的關(guān)系。6ppt課件等溫線(xiàn)的形狀是重要的色譜特性之一。它反映了一定溫度下，吸附劑對(duì)溶液中某一組分的吸附能力。對(duì)某一體系，組分的分布取決于吸附等溫線(xiàn)，它有三種類(lèi)型：線(xiàn)型、凸型和凹型。通常在低濃度時(shí)，每種等溫線(xiàn)均呈線(xiàn)型，而在高濃度時(shí)，等溫線(xiàn)則呈凸型或凹型。7ppt課件8ppt課件2.吸附劑2.1對(duì)吸附劑的要求1）顆粒要有一定的細(xì)度且粒度要均勻2）具有較大的吸附表面積和一定的吸附能力3）與洗脫劑、樣品不起化學(xué)反應(yīng)，且不溶于洗脫劑中9ppt課件2.2常用吸附劑無(wú)機(jī)類(lèi)：氧化鋁、硅膠、硫酸鈣、滑石粉、硅藻土等。有機(jī)類(lèi)：活性炭、淀粉、蔗糖等。其中以硅膠和氧化鋁較為常用。10ppt課件1）氧化鋁優(yōu)點(diǎn)：分離能力強(qiáng)、活性可控分類(lèi)：酸性、中性、堿性以中性氧化鋁使用較多,用來(lái)分離生物堿、揮發(fā)油、萜類(lèi)、甾體、蒽醌以及在酸堿中不穩(wěn)定的苷類(lèi)、醌、內(nèi)酯等化合物?；罨瘻囟龋?00～400℃11ppt課件2）硅膠優(yōu)點(diǎn)：適用于各類(lèi)樣品的分離吸附能力：取決于骨架表面的硅醇基吸附機(jī)理：硅膠表面羥基作為質(zhì)子給予體，通過(guò)氫鍵形式將溶質(zhì)吸附在硅膠表面。由于硅膠具有弱酸性，所以選擇性地保留胺類(lèi)和其它堿性化合物?；罨瘻囟龋?05～110℃12ppt課件2.3吸附劑的活性吸附劑的活性與含水量有一定的關(guān)系。吸附劑在使用前必須先經(jīng)過(guò)活化處理?；罨涸谝欢囟认?，加熱除去水分以增強(qiáng)活性的過(guò)程。13ppt課件硅膠含水量(％)活性級(jí)別氧化鋁含水量(％)0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ1514ppt課件3.

色譜條件的選擇在吸附色譜中，除了正確選擇吸附劑外，還可以通過(guò)流動(dòng)相的選擇來(lái)改變K值，或改變一對(duì)化合物的K值比，從而使它們的K值有最大的差別而達(dá)到分離。流動(dòng)相在色譜分析中除了起著溶質(zhì)通過(guò)色譜柱的作用，還影響著溶質(zhì)的分配系數(shù)，所以在色譜分析中流動(dòng)相的選擇也很重要。極性較大的化合物可以比較強(qiáng)的從溶液中被吸附劑吸附，需要極性較大的洗脫劑才能洗脫下來(lái)。15ppt課件選擇色譜分離條件時(shí)，必須從吸附劑、被分離物質(zhì)、流動(dòng)相三方面綜合考慮。16ppt課件4.

操作方法—薄層色譜4.1基本概念

1）薄層色譜法將吸附劑（或載體）均勻地鋪在玻璃板或塑料板、鋁箔、聚酯薄膜上，形成薄層，把要分離的樣品點(diǎn)加在薄層上，然后用合適的溶劑展開(kāi)而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。17ppt課件2）比移值Rf

在薄層色譜法中，常用比移值Rf來(lái)表示各組分在色譜中的保留行為。

Rf(A)=b/c

Rf(B)=a/c18ppt課件在給定條件下，Rf值為常數(shù)，其值在0～1之間。當(dāng)Rf值為0時(shí)，表示化合物在薄層上不隨溶劑的擴(kuò)散而移動(dòng)，仍在原點(diǎn)位置；Rf為1時(shí)，表示溶質(zhì)不進(jìn)入固定相，即表示溶質(zhì)和溶劑同步移動(dòng)。Rf值：一般要求0.2～0.8

最佳范圍0.3～0.5。19ppt課件3）薄層色譜法的特點(diǎn)展開(kāi)時(shí)間短，一般只需十幾到幾十分鐘；分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中；靈敏度高，通常用量為幾至幾十微克；顯色方便；儀器簡(jiǎn)單，操作方便。20ppt課件4.2操作技術(shù)薄層色譜法的操作步驟：選擇—制板—點(diǎn)樣—展開(kāi)—斑點(diǎn)的檢出—定性定量21ppt課件1）選擇(1)選板—玻璃板表面光滑、平整清潔(2)固定相：吸附劑；粘合劑(3)流動(dòng)相(4)顯色劑22ppt課件2）制板薄層板的制備，就是將吸附劑均勻地涂鋪在玻璃板上，使成薄層稱(chēng)之為制板。制板的步驟：(1)吸附劑的涂布(2)板的活化23ppt課件(1)吸附劑的涂布常用薄板：加粘合劑的硬板和不加粘合劑的軟板一般氧化鋁采用軟板多，而硅膠常采用硬板。硬板的涂鋪方法：傾注法、平鋪法、涂鋪器、噴霧法24ppt課件(2)板的活化

鋪成的薄層，必需置于水平臺(tái)面上晾干（也可以熱風(fēng)吹干），再置烘箱中活化即可。25ppt課件

3）點(diǎn)樣

薄層分析時(shí)，一般使用微量注射器或毛細(xì)管點(diǎn)樣。注意事項(xiàng)：（1）溶劑應(yīng)易揮發(fā)或用流動(dòng)相。（2）樣品濃度合適，一般對(duì)照品濃度宜控制在幾mg/ml。26ppt課件（3）點(diǎn)樣體積宜在20ml以下，點(diǎn)加量一般為幾~幾十微克，直徑以小于3mm為宜。少量多次點(diǎn)加。（4）點(diǎn)樣時(shí)，原點(diǎn)距離底邊、兩側(cè)邊以及點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離均應(yīng)在1~1.5cm。（5）要求原點(diǎn)直徑一致，點(diǎn)樣間距精確。所有原點(diǎn)應(yīng)在同一水平線(xiàn)上，斑點(diǎn)面積也盡可能一致。27ppt課件（6）用于定量或分離提純時(shí)，往往沿著起始線(xiàn)點(diǎn)加樣品成一條狀，以使點(diǎn)加的量相應(yīng)增多。（7）點(diǎn)樣時(shí)最好在密閉容器中或比較干燥的條件下完成，避免薄板吸收水分降低活性，若在空氣中點(diǎn)樣，時(shí)間最好在10分鐘內(nèi)完成。點(diǎn)樣完畢后使溶劑揮干，再選用適當(dāng)溶劑展開(kāi)。28ppt課件4）展開(kāi)（1）展開(kāi)原理將薄板一端浸入展開(kāi)劑，點(diǎn)樣處不可接觸展開(kāi)劑，展開(kāi)劑借助毛細(xì)作用上升，帶動(dòng)樣品中組分的遷移。29ppt課件（2）展開(kāi)箱的分類(lèi)常規(guī)飽和箱（NS）用溶劑飽和的濾紙作襯里使展開(kāi)箱充分飽和（CS）夾心板箱，可減少展開(kāi)箱的體積（3）展開(kāi)劑的選擇首選單元溶劑，再選混合溶劑（由簡(jiǎn)至繁）30ppt課件（4）邊緣效應(yīng)①定義：點(diǎn)于同一薄層的同一物質(zhì)的斑點(diǎn)，在色譜展開(kāi)過(guò)程中，靠薄層邊緣處斑點(diǎn)的Rf值與中心區(qū)域斑點(diǎn)的Rf值有所不同，此種現(xiàn)象稱(chēng)為邊緣效應(yīng)。②產(chǎn)生原因：邊緣效應(yīng)多數(shù)出現(xiàn)在極性強(qiáng)弱不等的混合溶劑展開(kāi)系統(tǒng)中，用單一組分展開(kāi)劑，邊緣效應(yīng)較為少見(jiàn)。31ppt課件③減少邊緣效應(yīng)的辦法最好用較小體積的展開(kāi)缸或?qū)⒈釉诟變?nèi)放置一定時(shí)間，待溶劑蒸汽達(dá)到飽和后再展開(kāi)；如在展開(kāi)缸內(nèi)壁貼上浸濕展開(kāi)劑的濾紙條，效果也很好；如采用3cm以下的狹小薄板，只點(diǎn)2～3個(gè)點(diǎn)時(shí)，也會(huì)減小邊緣效應(yīng)。32ppt課件5）斑點(diǎn)的檢出（1）光學(xué)檢出法（2）顯色劑法顯色劑種類(lèi)：專(zhuān)屬型顯色劑、通用型顯色劑33ppt課件6）定性與定量分析定性分析（1）用保留值定性－Rf（2）用多種溶劑系統(tǒng)定性定量分析（1）斑點(diǎn)捕集后洗脫測(cè)定法（2）薄層掃描法34ppt課件影響Rf值的因素：分離對(duì)象的化學(xué)結(jié)構(gòu)、固定相的組成及性質(zhì)、流動(dòng)相的組成及性質(zhì)、介質(zhì)的影響（包括實(shí)驗(yàn)室及展開(kāi)箱的濕度、溫度、飽和與否、上樣量等等）解決方法：為了解決由于Rf值重現(xiàn)性差，進(jìn)行定性困難的問(wèn)題，也可以采用相對(duì)比移植Rst來(lái)定性。

Rst＝Rf(i)/Rf(s)35ppt課件薄層掃描法定義：直接測(cè)量板上被分離化合物斑點(diǎn)的吸收、反射、熒光等進(jìn)行定量的方法。分類(lèi)：吸收掃描法和熒光掃描法掃描方式：線(xiàn)性?huà)呙璺ê弯忼X掃描法定量方法：外標(biāo)法—外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)兩點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)法36ppt課件優(yōu)點(diǎn)：快速、高效、靈敏主要不同：吸附劑顆粒小薄層厚度薄點(diǎn)樣直徑小展開(kāi)方式不同高效薄層色譜37ppt課件§2分配色譜法

分配色譜是將某種溶劑涂布在固體顆粒表面或紙纖維上形成一層液膜作為固定相，利用各組分在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)分離的方法。38ppt課件1.基本原理

分配定律：分配色譜以直線(xiàn)型等溫線(xiàn)最普遍，洗脫峰峰形對(duì)稱(chēng)而尖銳。

在分配色譜中，用溶劑極性來(lái)描述分配作用的，因此溶解度的“相似相溶”經(jīng)驗(yàn)規(guī)則可用于分配色譜中。

39ppt課件2.分配色譜的分類(lèi)正相色譜：固定相的極性大于流動(dòng)相的極性保留：極性越大的組分保留越強(qiáng)反相色譜：流動(dòng)相的極性大于固定相的極性保留：極性越小的組分保留越強(qiáng)40ppt課件3.載體作用：負(fù)載固定液要求：化學(xué)惰性，粒度小而均勻，純凈，與固定液間有較大的分子間作用力。常用載體：硅膠、硅藻土、纖維素41ppt課件4.固定液相與流動(dòng)液相溶劑對(duì)選擇原則1）不相互溶（預(yù)先互飽和）2）Ss>Sm(提高分析效率)42ppt課件固定相與流動(dòng)相的選擇

先采用對(duì)各組分溶解度均較大的溶劑為洗脫劑

根據(jù)分離情況改變洗脫劑的組成和比例（即在流動(dòng)相中加入一些別的溶劑），調(diào)整各組分的分離及洗脫速率

43ppt課件5.操作方法

5.1柱色譜

固定相的涂布與裝柱分配柱色譜的加樣和洗脫5.2紙色譜

色譜紙的選擇和處理點(diǎn)樣及展開(kāi)分離混合物，Rf值之差最好大于0.05以免斑點(diǎn)重疊；鑒別單一化合物，Rf值最好在0.4～0.6之間。44ppt課件6.應(yīng)用分配色譜適用于各種類(lèi)型化合物的分離，尤其適用于是強(qiáng)極性親水性物質(zhì)的分離（如：脂肪酸和多元醇）優(yōu)點(diǎn)：較好的重現(xiàn)性，并可根據(jù)K值預(yù)示分離結(jié)果。分配系數(shù)在較大的濃度范圍內(nèi)是常數(shù)，其洗脫峰多數(shù)為對(duì)稱(chēng)峰，峰形尖銳。在大多數(shù)情況下，均能找到一組合適的溶劑進(jìn)行分離。45ppt課件吸附色譜法:親脂性物質(zhì)分配色譜法:親水性物質(zhì)46ppt課件§3離子交換色譜法以離子交換樹(shù)脂為固定相，用水或與水混合的溶劑作為流動(dòng)相，利用離子交換樹(shù)脂對(duì)各組分離子交換能力（親合力）的不同而使實(shí)現(xiàn)分離的方法稱(chēng)為離子交換色譜法(ionexchangechromatography,IEC)。

47ppt課件1.離子交換樹(shù)脂的分類(lèi)離子交換樹(shù)脂主要由高分子聚合物的骨架和活性基團(tuán)所組成，它的骨架具有特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以聚苯乙烯型最常用。根據(jù)所交換離子的電荷可分為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。48ppt課件1.1陽(yáng)離子交換樹(shù)脂根據(jù)可交換的離子的不同氫型樹(shù)脂－－含有－SO3H,－COOH,－OH,－SH,－PO3H2等酸性基團(tuán)鹽型樹(shù)脂－－含有鈉鹽、鉀鹽依據(jù)其酸性強(qiáng)度強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換劑弱酸型陽(yáng)離子交換劑樹(shù)脂的酸性強(qiáng)度一般按下列次序遞減：R－SO3H＞HO-R-SO3H＞R－PO3H2＞R－COOH＞R－OH

49ppt課件磺化苯乙烯樹(shù)脂由苯乙烯和二乙烯苯經(jīng)聚合，磺化而成，是應(yīng)用最普遍的離子交換樹(shù)脂50ppt課件交換反應(yīng)：

R-SO3-H++Na++Cl-R-SO3-Na++H++Cl-

51ppt課件1.2陰離子交換樹(shù)脂根據(jù)可交換的離子的不同氫氧型樹(shù)脂－－N+R3OH-

氯型樹(shù)脂－－N+R3Cl-

依據(jù)其堿性強(qiáng)度強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂弱堿性陰離子交換樹(shù)脂52ppt課件2.離子交換樹(shù)脂的特性2.1交聯(lián)度定義：表示離子交換樹(shù)脂中交聯(lián)劑的含量，通常以重量百分比來(lái)表示。高交聯(lián)度樹(shù)脂－網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，網(wǎng)眼小，剛性較強(qiáng)，能承受一定的壓力；孔穴較多；溶脹較小，吸水量少。低交聯(lián)度樹(shù)脂－網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，網(wǎng)眼大，具有較好的滲透性，但存在著易變形和耐壓差等缺點(diǎn)。53ppt課件根據(jù)分離對(duì)象選擇樹(shù)脂交聯(lián)度：

分離小分子物質(zhì)（氨基酸）——選擇8%樹(shù)脂為宜分離分子量較大的物質(zhì)（多肽）——選擇2－4%樹(shù)脂為宜54ppt課件2.2交換容量定義——是指每克干樹(shù)脂中真正參加交換反應(yīng)的基團(tuán)數(shù)。常用單位為mmol/g。交換容量是一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，通常以實(shí)測(cè)值為準(zhǔn)。55ppt課件2.3溶脹定義——當(dāng)將樹(shù)脂浸入水中后，有大量水進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)部，引起樹(shù)脂膨脹的現(xiàn)象稱(chēng)為溶脹。溶脹的程度取決于交聯(lián)度的高低——交聯(lián)度高，溶脹??；交聯(lián)度低，溶脹大。一般說(shuō)來(lái)，lg樹(shù)脂最大吸水量為lg。56ppt課件2.4粒度

離子交換樹(shù)脂的顆粒大小，一般是以溶脹狀態(tài)所能通過(guò)的篩孔來(lái)表示。實(shí)際操作根據(jù)需要選用不同粒度的樹(shù)脂：交換純水常用10－50目樹(shù)脂，分析用樹(shù)脂常用100－200目。57ppt課件3.離子交換平衡離子交換反應(yīng)可用下式表示：R-A++B+R-B++A+58ppt課件離子交換反應(yīng)平衡時(shí)：選擇性系數(shù)（交換系數(shù)）〔R-A+〕〔R-B+〕分別表示在樹(shù)脂相中A+、B+

的離子濃度〔A+〕、〔B+〕分別表示A+、B+離子在溶液中的濃度。59ppt課件當(dāng)各離子強(qiáng)度和樹(shù)脂的填充狀況一定時(shí)，KA/B為常數(shù)。KA/B＞1，說(shuō)明樹(shù)脂對(duì)B比對(duì)A有更大的親合力離子的相對(duì)親合力將隨水合離子半徑的增加和電荷的減小而降低。60ppt課件離子交換色譜的分離機(jī)理

利用樣品組分選擇性系數(shù)的不同而進(jìn)行分離——主要用于金屬離子的分離。各種離子對(duì)離子交換樹(shù)脂的親合力不同，當(dāng)兩種或兩種以上的離子共存時(shí)，利用它們的選擇性系數(shù)的不同，從而在離子交換柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，它們的移動(dòng)速度也不同，達(dá)到分離。61ppt課件利用各組分離解度的差別而進(jìn)行分離——用于弱酸性、堿性組分分離調(diào)整流動(dòng)相的pH，使組分中的各個(gè)不同成分以離子型或以游離型的不同形式出現(xiàn)。由于游離型(中性分子)成分不被交換樹(shù)脂所吸附，而和離子型成分相分離。例如用強(qiáng)酸性樹(shù)脂來(lái)分離氨基酸即利用此原理62ppt課件形成絡(luò)離子后進(jìn)行離子交換分離對(duì)于選擇性系數(shù)相同的兩個(gè)組分，如A與B，可使其與適當(dāng)?shù)慕j(luò)合劑形成絡(luò)離子，然后利用不同絡(luò)離子與離子交換樹(shù)脂的親合力不同而進(jìn)行分離。63ppt課件經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：

在低濃度水溶液及常溫下，陽(yáng)離子的交換能力隨其電荷的升高而增大。

Th4+＞Al3+＞Ca2+＞Na+常溫下，在低濃度水溶液中，等價(jià)陽(yáng)離子的交換親合力隨水合離子半徑增大而變小，隨其裸離子半徑增大而變大。

Cs+＞Rb+＞K+＞Na+＞Li+Ra+＞Ba+＞Sr2+＞Ca2+＞Mg2+＞Be2+

64ppt課件在強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中一價(jià)陽(yáng)離子的親合力順序?yàn)椋篈g+＞Tl+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH3+＞Na+＞H+＞Li+

二價(jià)陽(yáng)離子的親合力順序?yàn)椋築a2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg2+＞UO22+稀土元素的親合力隨原子序數(shù)增大而減小，其順序?yàn)椋篖a3+＞Ce3+＞Pr3+＞Nd3+＞Sm3+＞Eu3+＞Gd3+＞Tb3+＞Dy3+＞Y3+＞Ho3+＞Ev3+＞Tm3+＞Yb3+＞Lu3+＞Sc3+65ppt課件陰離子的親合力受陰離子的電荷數(shù)，離子的大小，交換離子的濃度，以及樹(shù)脂的性質(zhì)所影響。

在強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂中，陰離子的親合力順序?yàn)椋簷幟仕岣綪O43-＞SO42-＞C2O42-＞I-＞HSO4-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞CN-＞NO2-＞Cl-＞HCOO-＞CH3COO-＞OH-＞F-在弱堿性陰離子交換樹(shù)脂中，其親合力順序?yàn)椋篛H-＞SO42-＞CrO42-＞檸檬酸根＞酒石酸根＞NO3-＞AsO43-＞PO43-＞MnO42-＞CH3COO-＝I-＞Br-＞Cl-＞F-66ppt課件4.操作方法及應(yīng)用4.1樹(shù)脂的處理和再生

陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：先將樹(shù)脂浸于蒸餾水中使其溶脹，然后用5%－10%鹽酸處理使其變?yōu)闅湫汀?/p>

陰離子交換樹(shù)脂：用10%NaOH或10