酶工程制藥匯總課件

2023/7/201藥劑教研室昝旺生命的催化劑——酶工程2023/7/2022023/7/203酶人植物動(dòng)物微生物2023/7/2042023/7/2052023/7/206……2023/7/207酶與醫(yī)藥1、疾病診斷：谷丙轉(zhuǎn)氨酶診斷肝炎、葡萄糖氧化酶診斷糖尿病2、疾病治療：胃蛋白酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶（SOD）、尿激酶、L-天冬酰胺酶（治療白血病）、細(xì)胞色素C等3、藥物生產(chǎn)：應(yīng)用酶的特異性催化功能將相應(yīng)前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成藥物，如青霉素?；钢圃祛^孢霉素和半合成青霉素4、分析檢測(cè)：酶聯(lián)免疫檢測(cè)2023/7/208一掀起酶的蓋頭來2023/7/209什么是酶？2023/7/2010維爾斯塔特

酶既不是蛋白質(zhì)，也不是糖類，想得到純凈的酶是不可能的！酶都有兩個(gè)部分：活性基團(tuán)和膠質(zhì)載體。2023/7/2011酶是蛋白質(zhì)酶是催化劑酶是具有催化作用的蛋白質(zhì)薩姆納小樣兒，你OUT了！2023/7/2012酶有哪些特點(diǎn)呢？催化效率高專一性強(qiáng)反應(yīng)條件溫和催化活性受到調(diào)節(jié)和控制酶的催化效率是其它類型催化劑的107-1013倍，即比沒有催化劑時(shí)高1千萬到10萬億倍！2023/7/2013二酶的故鄉(xiāng)在哪里2023/7/2014酶從哪里來？化學(xué)合成從生物中分離提取微生物種類繁多，酶的種類齊全生長(zhǎng)繁殖快，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，原料來源豐富，價(jià)廉經(jīng)濟(jì)效益好微生物有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可通過基因工程培育新的高產(chǎn)菌株2023/7/2015

近年來，科學(xué)家們從微生物里發(fā)現(xiàn)的酶就有2500多種，各國(guó)申請(qǐng)的酶制劑方面的專利有1000多種。2023/7/2016微生物產(chǎn)酶：菌種選育發(fā)酵生產(chǎn)分離純化2023/7/2017三人類為什么離不開酶2023/7/2018酶與生命同行享受美味佳肴需要酶“吃的是草，擠的是奶”2023/7/2019四理解酶促反應(yīng)2023/7/2020什么是酶促反應(yīng)？酶促反應(yīng)（Enzymecatalysis）又稱酶催化或酵素催化作用，指的是由酶作為催化劑進(jìn)行催化的化學(xué)反應(yīng)。2023/7/2021酶促反應(yīng)有哪些特點(diǎn)呢？高度特異性高度催化效率高度不穩(wěn)定性酶活力的調(diào)節(jié)控制2023/7/2022影響酶促反應(yīng)的因素有哪些？底物濃度酶濃度pH值溫度激活劑/抑制劑2023/7/2023什么是酶工程？酶工程（enzymeengineering）：利用酶或細(xì)胞所具有的特異催化功能，或?qū)γ高M(jìn)行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項(xiàng)技術(shù)。酶工程就是將酶或者微生物細(xì)胞，動(dòng)植物細(xì)胞，細(xì)胞器等在一定的生物反應(yīng)裝置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)并應(yīng)用于社會(huì)生活的一門科學(xué)技術(shù)。它包括酶制劑的制備，酶的固定化，酶的修飾與改造及酶反應(yīng)器等方面內(nèi)容。酶工程的應(yīng)用，主要集中于食品工業(yè)，輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。2023/7/2024酶工程酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用酶的生產(chǎn)酶的改性酶的應(yīng)用酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的技術(shù)過程酶的生物合成酶的提取酶的分離純化酶分析修飾酶分子定向進(jìn)化酶固定化酶非水相催化酶反應(yīng)器各領(lǐng)域中的酶2023/7/20252023/7/2026一、酶的生產(chǎn)酶的生物合成酶的提取酶的分離純化2023/7/2027二、酶的改性酶分析修飾酶分子定向進(jìn)化酶固定化酶非水相催化2023/7/2028三、酶的應(yīng)用酶反應(yīng)器各領(lǐng)域中的酶2023/7/2029對(duì)產(chǎn)酶細(xì)胞有哪些要求呢？產(chǎn)酶量高（最好是產(chǎn)胞外酶的菌）非致病菌、安全可靠、無毒性產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化，不易感染噬菌體利于酶的分離純化一、產(chǎn)酶細(xì)胞的選擇2023/7/2030目前常用的產(chǎn)酶微生物：大腸桿菌（分泌胞內(nèi)酶）、枯草桿菌、啤酒酵母、青霉、鏈霉菌等。另外，植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞也常有使用。2023/7/2031二、產(chǎn)酶工藝條件的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制1.pH值2.溫度3.溶解氧2023/7/2032三、提高產(chǎn)酶量的措施（一）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

1.添加誘導(dǎo)物

2.控制阻遏物的濃度

3.添加表面活性劑

4.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑2023/7/2033（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

1.溫度控制

2.pH值控制

3.溶解氧的控制

4.光照的控制

5.前體的添加

6.刺激劑的應(yīng)用2023/7/2034（三）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

1.溫度的控制

2.pH值的控制

3.滲透壓的控制

4.溶解氧的控制2023/7/2035酶的分離提純過程應(yīng)注意以下要求低溫操作不能劇烈攪拌加保護(hù)劑，如EDTA對(duì)純化過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)想一想：為什么需要有這些注意事項(xiàng)？2023/7/2036一、酶分離純化的一般程序原材料的選擇和預(yù)處理酶的分離酶的精制酶的濃縮干燥和結(jié)晶綜上所訴，就是：細(xì)胞破碎、抽提、純化2023/7/2037二、酶的提?。ㄒ唬┘?xì)胞破碎機(jī)械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法酶學(xué)破碎法2023/7/2038機(jī)械破碎法：通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力作用，使細(xì)胞破碎的方法，稱為機(jī)械破碎法。1.搗碎法2.研磨法3.勻漿法2023/7/2039物理破碎法：通過各種物理因素（如溫度、壓力、超聲波等）的作用，使細(xì)胞破碎的方法。1.溫度差破碎法2.壓力差破碎法3.超聲波破碎法2023/7/2040化學(xué)破碎法：通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎的方法。酶促破碎法：通過存在于細(xì)胞內(nèi)部的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法。2023/7/2041（二）酶的抽提（extraction）

在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇ɑ蛉芤海┨幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇ɑ蛉芤海┲械倪^程。2023/7/2042在酶的抽提過程中，首先應(yīng)當(dāng)做什么呢？應(yīng)當(dāng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解特性，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?023/7/2043鹽溶液提取鹽溶現(xiàn)象，即低濃度的中性鹽可使電解質(zhì)的溶解度大大增加。

原理是由于鹽離子和電解質(zhì)離子的極性基團(tuán)間的靜電作用而導(dǎo)致溶質(zhì)溶解度增加。

鹽濃度一般在0.05-0.2mol/L。2023/7/2044稀酸稀堿溶液提取

注意：

pH值不能太極端！2023/7/2045有機(jī)溶劑提取適用于與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶。

常用的有機(jī)溶劑有乙醇和丙酮等。

通常在0℃下攪拌進(jìn)行。2023/7/2046（三）沉淀分離

通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶在溶液中的溶解度降低，從溶液中析出沉淀，而與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。鹽析沉淀法等電沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法復(fù)合沉淀法選擇性變性沉淀法2023/7/2047鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離。等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離。選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離。2023/7/2048酶的分離純化方法還有：離心分離、過濾與膜分離、層析分離、電泳分離、萃取分離等等等等。2023/7/2049酶分子修飾（enzymemoleculemodification）

通過各種方法直接使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改進(jìn)酶的催化特性的技術(shù)過程。酶分子的主鏈修飾酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾酶分子的組成單位置換修飾酶分子的金屬離子置換修飾酶分子的物理修飾2023/7/2050酶分子的主鏈修飾主鏈切斷修飾主鏈連接修飾①若主鏈的斷裂引起酶活性中心的破壞，酶將喪失其催化功能；②若主鏈斷裂后，仍然可以維持酶活性中心的空間構(gòu)想，則酶的催化功能可以保持不變或損失不多，但其抗原性等特性將發(fā)生改變；③若主鏈的斷裂有利于酶活性中心的形成，則可使酶分子顯示其催化功能或使酶活性提高。2023/7/2051酶分子的側(cè)鏈修飾通過酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾，可以提高酶的活性、增加酶的穩(wěn)定性、降低酶的抗原性，并且可能引起酶催化特性和催化功能的改變，以提高酶的使用價(jià)值。蛋白類酶主要由蛋白質(zhì)組成，酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)，主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基。核酸類酶主要核糖核酸組成，酶RNA的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成RNA的核苷酸殘基上的功能團(tuán)。2023/7/2052酶分子組成單位置換通過修飾可以提高酶的催化效率通過修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性通過修飾可以使酶的專一性發(fā)生改變通過核苷酸置換修飾可以獲得各種人造核酸類酶2023/7/2053酶分子定向進(jìn)化（enzymemoleculedirectedevolution）

模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。2023/7/2054酶分子基因基因隨機(jī)突變突變基因的定向選擇正突變基因進(jìn)化酶反復(fù)進(jìn)行去除負(fù)突變基因和中性突變基因酶分子定向進(jìn)化的基本過程2023/7/2055酶固定化（enzymeimmobilization）將酶固定在載體上，制備固定化酶的技術(shù)過程。固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶稱為固定化酶（immobilizedenzyme）。2023/7/2056為什么要對(duì)酶進(jìn)行固化？酶有些不足之處：酶的穩(wěn)定性較差酶的一次性使用產(chǎn)物的分離純化比較難2023/7/2057一、固定化酶的制備

固定化酶（ImmobilizedEnzyme）通過物理化學(xué)手段，將酶束縛于水不溶性的載體上或一定空間內(nèi)，使酶變成不易隨溶液流失但能發(fā)揮催化作用。2023/7/2058一、傳統(tǒng)的酶和細(xì)胞固定化方法2023/7/20591、載體結(jié)合法

是將酶固定于水不溶性載體上。2023/7/2060是利用酶和載體間非特異性物理吸附將酶固定在載體表面。常用載體有有機(jī)載體：纖維素、淀粉等無機(jī)載體：氧化鉛、皂土、高嶺土、多孔玻璃等物理吸附法物理吸附作用：范德華力、氫鍵、疏水，靜電作用等。特點(diǎn)：最早使用，對(duì)酶活力影響小，但酶與載體間結(jié)合力弱。2023/7/2061常用載體：二乙基氨基乙基纖維素（DEAE）羧甲基（CM）－纖維素離子結(jié)合法是將酶通過離子鍵作結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上。特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，條件溫和；但結(jié)合力不強(qiáng)2023/7/2062共價(jià)結(jié)合法將酶分子上非活性部位功能基團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵。酶的非活性部位功能團(tuán)載體表面反應(yīng)基團(tuán)氨基、羧基、咪唑基、巰基等2023/7/2063優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，可重復(fù)使 用，是目前研究最為活躍的方法。缺點(diǎn)：反應(yīng)劇烈，酶活性易受影響。2023/7/20642、交聯(lián)法酶分子的交聯(lián)基團(tuán)：－NH2、－OH、－SH等。常用交聯(lián)劑：戊二醛用雙功能和多功能試劑，使酶與交聯(lián)試劑之間形成共價(jià)鍵的固定化方法。類似于共價(jià)結(jié)合法，區(qū)別在于載體不同。制備較困難，活性損失較大。2023/7/20653、包埋法載體與酶溶液混合后，通過物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中。常用載體：明膠、瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、海藻酸鈉等。優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，酶活力回收較高。缺點(diǎn)：酶易泄漏，擴(kuò)散受限。2023/7/2066網(wǎng)格型將酶或者細(xì)胞包埋于高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型將酶或者細(xì)胞包埋于高分子半透膜中。2023/7/2067酶的固定化方法2023/7/2068固定化細(xì)胞的制備

細(xì)胞固定化技術(shù)，也稱為第二代固定化酶。為了減少?gòu)奈⑸锛?xì)胞中分離提純酶的麻煩，直接利用微生物細(xì)胞內(nèi)的復(fù)合酶系統(tǒng)，所以將細(xì)胞固定化。2023/7/2069二、固定化酶的性質(zhì)和指標(biāo)酶固定化后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，活力下降。帶來擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間障礙、載體的分配效應(yīng)等2023/7/20701.固定化后酶活力的改變大多數(shù)情況下，固定化后酶活力下降。固定化胰蛋白酶對(duì)底物酪蛋白只顯示原活力的30%，而對(duì)底物苯酞精氨酸-對(duì)硝基酰替苯胺的活力保持80%。一般認(rèn)為高分子底物受空間位阻的影響比低分子底物大。2023/7/2071酶活力改變的原因空間構(gòu)象發(fā)生變化，酶的活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生了結(jié)合?？臻g位阻，即酶活性中心與底物接近受阻。包埋時(shí)，酶被高分子半透膜包圍，大分子不能透過。2023/7/20722.酶的穩(wěn)定性變化指對(duì)溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度，固定化酶穩(wěn)定性一般都升高。

（1）熱穩(wěn)定性耐熱性提高，最適溫度提高，反應(yīng)能在較高溫度下進(jìn)行（2）對(duì)有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高具體表現(xiàn)在：

（3）對(duì)pH、蛋白酶、儲(chǔ)存和操作條件的穩(wěn)定性提高2023/7/20733.固定化酶的最適溫度變化由于固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高。2023/7/20744.固定化酶的最適pH發(fā)生變化酶固定化后，對(duì)底物作用的最適pH和酶活力-pH曲線常發(fā)生偏移。發(fā)生偏移的原因是微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響。2023/7/20755.固定化酶的米氏常數(shù)變化主要是由于高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化及載體的影響引起酶與底物親和力變化2023/7/2076酶反應(yīng)器（enzymereactor）：用于各種酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備。生物反應(yīng)器發(fā)酵罐2023/7/2077反應(yīng)器的種類1.攪拌罐反應(yīng)器（batchstirredtankreactor,BSTR)特點(diǎn)：底物與酶一次性投入反應(yīng)器，反應(yīng)完成后產(chǎn)物一次性取出。優(yōu)點(diǎn)：裝置較簡(jiǎn)單．造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小。缺點(diǎn)：固定化酶經(jīng)反復(fù)回收使用時(shí)．易失去活性．故在工業(yè)生產(chǎn)中，很少用于固定化酶，主要用于游離酶反應(yīng)。2023/7/20782.連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反應(yīng)器

（continuousstirredtankreactor,CSTR）向反應(yīng)器投入固定化酶和底物溶液。不斷攪拌，反應(yīng)達(dá)平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流入底物溶液．同時(shí)以相同流速輸出反應(yīng)液（含產(chǎn)物）。缺點(diǎn)：攪拌槳產(chǎn)生的剪切力較大，容易引起固定化酶的破壞。2023/7/20793.填充床反應(yīng)器

（packbedreactor,PBR)將固定化酶填充于反應(yīng)器內(nèi)，制成穩(wěn)定的柱床，然后，通入底物溶液，以一定的流速收集輸出的轉(zhuǎn)化液（含產(chǎn)物)。工業(yè)生產(chǎn)中常采用上向方式，可以避免下向流動(dòng)的液壓對(duì)柱床的影響目前應(yīng)用最普遍，發(fā)表的文章也最多。當(dāng)?shù)孜锶芤汉腆w顆?；蝠ざ群艽髸r(shí)，不宜采用PBR，因?yàn)楣腆w顆粒易堵塞柱床。2023/7/20804.流化床反應(yīng)器

（packbedreactor,PBR）底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器底部向上通過固定化酶柱床，使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。適于處理粘性強(qiáng)和含有固體顆粒的底物。2023/7/20815.循環(huán)反應(yīng)器

（recyclereactor,RCR)進(jìn)料口與出料口以管道相連，反應(yīng)過程中部分輸出液與新加入的底物液混合，再進(jìn)入反應(yīng)床進(jìn)行循環(huán)。轉(zhuǎn)化率較高。2023/7/2082

酶反應(yīng)器多種多樣，不同的反應(yīng)器有不同特點(diǎn)。