高效液相色譜介紹和應(yīng)用資料課件

主要內(nèi)容一、高效液相色譜法簡介二、高效液相色譜系統(tǒng)三、高效液相色譜法分類四、HPLC使用注意事項(xiàng)高效液相法色譜簡介高效液相色譜法的發(fā)展高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)起始于60年代后期，是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的一種分離分析方法。HPLC法的分離原理溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，與固定相(stationaryphase)發(fā)生吸附、分配、離子交換、排阻等作用，由于不同組分理化性質(zhì)不同，與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后流出色譜柱。高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)流程高壓泵進(jìn)樣器檢測(cè)器色譜工作站色譜柱高效液相譜系統(tǒng)輸液泵

輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。一個(gè)輸液泵只能控制一個(gè)輸液瓶，即只能用一種溶劑（單一或混合溶劑）進(jìn)行洗脫（等度洗脫）。由于等度洗脫用的流動(dòng)相組成始終保持恒定，所以只適合組分?jǐn)?shù)目少，性質(zhì)差別不大的樣本的分離。一元泵系統(tǒng)

對(duì)于組分多、性質(zhì)差別大的復(fù)雜樣本在一個(gè)條件下難以將各個(gè)組分洗脫下來，如在一個(gè)分析周期內(nèi)按程序改變流動(dòng)相的組成（如極性、離子強(qiáng)度和pH值)，使各組分在適當(dāng)條件下得到分離。二元泵系統(tǒng)

在一個(gè)分析周期內(nèi)依據(jù)被測(cè)組分的極性而按程序改變流動(dòng)相組成進(jìn)行洗脫的方法叫做梯度洗脫。優(yōu)點(diǎn)：能縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形。缺點(diǎn)：基線漂移。在不同儀器或色譜柱上較難重現(xiàn)。高壓/低壓梯度洗脫系統(tǒng)及特點(diǎn)由兩臺(tái)以上輸液泵將兩種以上溶劑分別送入混合器混合，然后進(jìn)入色譜柱的洗脫方式稱為高壓梯度洗脫。特點(diǎn)：梯度準(zhǔn)確度好。由一臺(tái)輸液泵通過比例閥和在線脫氣機(jī)完成的梯度洗脫方法稱為低壓梯度洗脫。特點(diǎn)：需要配備在線脫氣機(jī)，易發(fā)生時(shí)間滯后效應(yīng)?，F(xiàn)在的HPLC輸液泵多用柱塞往復(fù)泵，它的液缸容積可小至0.1ml，易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于梯度洗脫，而且由于改變電機(jī)轉(zhuǎn)速就能方便地調(diào)節(jié)流量，所以流量不受柱阻影響，輸液泵壓力可達(dá)400kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，雙泵系統(tǒng)較好地克服了輸出脈沖性較大的缺點(diǎn)。按雙泵的連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。溶劑的純度要高，否則重現(xiàn)性差；梯度混合的溶劑互溶性要好；進(jìn)樣之前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑峰；每次梯度洗脫之后要對(duì)色譜柱進(jìn)行充分的平衡，使之回到流動(dòng)相組成的初始濃度。示差折光檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感，不能進(jìn)行梯度系統(tǒng)。梯度洗脫注意事項(xiàng)檢測(cè)器檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。根據(jù)檢測(cè)原理可將其分為選擇性檢測(cè)器和通用型檢測(cè)器。檢測(cè)器選擇性紫外(VWD、DAD)熒光電化學(xué)通用型示差折光蒸發(fā)光散射質(zhì)譜幾種常用檢測(cè)器的主要性能UV熒光電化學(xué)質(zhì)譜蒸發(fā)光信號(hào)流速影響溫度影響檢測(cè)限(g/ml)池體積(μl)梯度洗脫樣品破壞吸光度無小10-102~10適宜無熒光強(qiáng)度無小10-132~7適宜無電流有大10-13＜1不宜無離子流強(qiáng)度無––適宜有散射光強(qiáng)無小10-9––適宜無檢測(cè)器的保養(yǎng)紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時(shí)打開檢測(cè)器，20分鐘后可以進(jìn)行檢測(cè)；在分析完閉后，先關(guān)紫外燈。（頻繁的開關(guān)燈會(huì)縮短燈的使用壽命）樣品池要常清洗柱溫箱HPLC分析一般在室溫條件下進(jìn)行,但適當(dāng)提高柱溫能降低流動(dòng)相黏度和柱前壓，有利于改善傳質(zhì)和提高分析速度，有利于提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性。高效液相色譜分類方法與特點(diǎn)

HPLC分類根據(jù)固定相可以分為：液-固色譜、液-液色譜及鍵合相色譜；根據(jù)分離原理可以分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、離子對(duì)色譜、排阻色譜等。鍵合相色譜分離原理：認(rèn)為吸附、分配兼有之。正相色譜：采用極性固定相（如硅膠、氨基與腈基鍵合相），流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入甲醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜：一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。

離子交換色譜：固定相是離子交換樹脂。緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。

改變流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度可以改善分離。排阻色譜法

固定相為有一定孔徑的多孔性填料。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。離子對(duì)色譜法主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。反相離子對(duì)色譜法常用ODS柱，流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保留時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。三、HPLC使用注意事項(xiàng)HPLC的日常操作條件最好是恒溫、恒濕溫度：15~30℃

相對(duì)濕度<80%房間應(yīng)有良好的通風(fēng)空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器避免光線直射遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備

（一）啟動(dòng)前檢查

1.流動(dòng)相是否過濾2.水與有機(jī)溶劑混合時(shí)溫度變化大，必須待恢復(fù)到室溫時(shí)方可使用，否則易產(chǎn)生氣泡。3.更換流動(dòng)相時(shí)注意兩種流動(dòng)相必須具有互溶性，更換溶劑的一般方法：（1）取少量準(zhǔn)備更換的流動(dòng)相放在清潔的燒杯中，取出吸濾器，將吸濾頭放在燒杯中用超聲波振蕩器振動(dòng)清洗干凈；（2）打開排液閥，按清洗鍵（purge），用新流動(dòng)相清洗泵中的流動(dòng)相；（3）關(guān)閉排液閥，啟動(dòng)泵，清洗流路；（4）連接色譜柱和檢測(cè)器，用新流動(dòng)相平衡色譜柱。4.更換不互溶性流動(dòng)相時(shí)應(yīng)先用異丙醇進(jìn)行置換，然后每步都按（1）~（4）進(jìn)行。5.更換緩沖鹽流動(dòng)相時(shí)，用純水清洗，每步都按1~4進(jìn)行。6.保持貯液瓶清潔，對(duì)專用貯液瓶應(yīng)定期清洗；用試劑瓶作貯液瓶時(shí)，要經(jīng)常更換。7.定期在稀硝酸溶液中超聲、清洗過濾器，保持過濾器暢通無阻。8.每天開始使用儀器時(shí)注意放空排氣，確保泵頭、流動(dòng)池以及其它流路系統(tǒng)中無氣泡存在。（二）泵的使用與維護(hù)注意事項(xiàng)1.防止任何固體微粒進(jìn)入泵體（0.2um或0.45um的微孔濾膜過濾）。2.流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性。3.流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)。4.泵工作時(shí)防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)會(huì)磨損柱塞、密封圈，導(dǎo)致漏液。5.輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形造成漏液。6.使用緩沖液后用兩通管連接管路及檢測(cè)池，先用純水沖洗，然后用甲醇沖洗。管路及檢測(cè)池沖洗干凈后再?zèng)_洗色譜柱。反相柱先用含5%~7%甲醇的水沖洗色譜柱（此時(shí)不要再連接檢測(cè)池），然后用甲醇或甲醇-水混合液沖洗。7.緩沖鹽不得在色譜柱中過夜。8.緩沖液使用前必須過濾。9.磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液易受到細(xì)菌和霉菌的影響，不得放置過夜，應(yīng)臨用現(xiàn)制。注意：用緩沖液后不能直接換用有機(jī)溶劑流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能貯存在塑料容器中。容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。容器應(yīng)定期清洗，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。1.使用流動(dòng)相溶解樣品--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)尤為重要

--保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀2.進(jìn)樣前最好使用<0.45um的膜進(jìn)行過濾。樣品處理

手動(dòng)進(jìn)樣閥操作注意點(diǎn)：1）樣品溶液必須用0.45um的濾膜過濾2）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針3）轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在進(jìn)樣閥的中間位置4）常用密封墊的材質(zhì)適用pH<10,樣品溶液pH小于10,換特氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-135）每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥定子轉(zhuǎn)子針頭密封墊彈簧不銹鋼套進(jìn)樣閥的保養(yǎng)色譜柱的保養(yǎng)8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::輸液時(shí)不要打開排液閥柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動(dòng)相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)樣樣品要提純控制絕對(duì)進(jìn)樣量加預(yù)柱預(yù)柱預(yù)柱套預(yù)柱芯

預(yù)柱套預(yù)柱芯裝色譜柱時(shí)應(yīng)按色譜柱上的箭頭方向安裝。一般不要倒沖色譜柱。每天工作結(jié)束后用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?清洗后塞住兩頭當(dāng)分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存注意：只能使用色譜級(jí)的溶劑!

不能使用舊的或未經(jīng)過濾的緩沖溶液流動(dòng)相的選擇采用“HPLC”級(jí)溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配（質(zhì)譜、ELSD不能用無機(jī)鹽緩沖液、用UV檢測(cè)器時(shí)注意溶劑的截止波長流動(dòng)相過濾頭產(chǎn)生的問題故障特征 “鬼峰”(由已被污染的過濾頭造成)

保留時(shí)間不斷改變(由于過濾頭堵塞或部分堵塞)清洗步驟：

1.水 2.稀硝酸

3.水 4.異丙醇

5.水注意：砂芯式濾頭不能超聲流路中形成氣泡引起的問題改變保留時(shí)間和峰面積

由于流動(dòng)相中形成氣泡對(duì)液流的不良影響及泵中形成氣泡使液流波動(dòng)峰變形柱中氣泡形成和累積使流動(dòng)相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測(cè)池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲輸液泵常見故障及相應(yīng)排除措施故障