第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1第1頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子所含的肽鏈數(shù)目，以及每條肽鏈中氨基酸的種類、數(shù)量和排列順序，以及肽鏈中各個原子和基團在空間的排部。2第2頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

二蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

三肽鍵和肽一3第3頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月肽鍵（PeptideBonds）是氨基酸連接的基本方式。1.肽鍵的結(jié)構(gòu)一、肽鍵和肽4第4頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月PeptidebondSinglebondDoublebond鍵長0.145nm0.133nm0.125nm5第5頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Fig.ThepeptidebondisshowninitsusualtransconfigurationofcarbonylOandamideH.6第6頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月小結(jié)：肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。

肽鍵是一個平面——肽鍵平面（peptideplane）或酰胺平面（amideplane)。多數(shù)情況下，為反式構(gòu)型。7第7頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2.肽的結(jié)構(gòu)氨基末端（N末端）羧基末端（C末端）肽鍵肽鍵肽鍵

結(jié)構(gòu)通式8第8頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月肽的命名(nomination)：如：Val-Ala-Lys-Gly-Arg

纈氨酰丙氨酰賴氨酰甘氨酰精氨酸絲氨酰甘氨酰酪氨酸9第9頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月肽的分類（classificationofpeptide）二肽(dipeptides)：三肽：3個氨基酸通過2個肽鍵相連。四肽：少于10AA成為寡肽(oligopeptides)多于10AA成為多肽(polypeptides)分子量小于10000Da稱為多肽大于10000Da稱為蛋白質(zhì)10第10頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

共價主鏈和側(cè)鏈11第11頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月小結(jié)：

蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式是肽鍵（peptidebond）。有的蛋白質(zhì)分子還具有二硫鍵(disulfidebond），有鏈間二硫鍵和鏈內(nèi)二硫鍵兩種形式。

肽鏈中的氨基酸由于形成肽鍵而成為不完整的分子，稱為氨基酸殘基（aminoacidresidue）。肽鏈骨干重復單位是：—N—C—C—12第12頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月3.

肽的物理和化學性質(zhì)—

短肽為晶體，熔點很高—

在水溶液中以兼性離子形式存在—

具旋光性?物理性質(zhì)（1）酸堿性質(zhì)：主要取決于游離末端的-NH2和-COOH及R基上可解離基團。?化學性質(zhì)13第13頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）化學反應(yīng)?茚三酮反應(yīng)?雙縮脲反應(yīng)雙縮脲O=CO=CNH2NH2NHCu2+OH-Cu2+O=CO=CNH2NH2NHC=OC=OH2NH2NHN紫紅色絡(luò)合物14第14頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月4.

天然存在的活性肽激素：胰島素催產(chǎn)素（8肽）加壓素（8肽）抗生素：短桿菌肽S（環(huán)狀10肽）放線菌D（含2個環(huán)狀5肽）毒素：-鵝膏蕈堿腦啡肽:

15第15頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

還原型谷胱甘肽16第16頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月短桿菌肽和短桿菌酪肽10肽抗生素。17第17頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月腦啡肽（5肽）已發(fā)現(xiàn)幾十種.如Met-腦啡肽（Tyr—Gly—Gly—Phe—Met）

Leu-腦啡肽（Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu）18第18頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)定義——指蛋白質(zhì)多肽鏈中aa的排列順序，包括二硫鍵的位置。19第19頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月1.

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)舉例

[英]Sanger等，1953FrederickSanger

胰島素（insulin）Mr:5700D含兩條肽鏈A鏈：20aaB鏈：31aa20第20頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月FigTheaminoacidsequenceofthetwochains

ofbovineinsulin,whicharejoinedbydisulfidecross-linkages.21第21頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2.一級結(jié)構(gòu)測定方法（DeterminingmethodsofPrimarystructureofaprotein)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。斷裂多肽鏈的二硫鍵。測定多肽鏈的氨基酸組成。分析多肽鏈的N末端和C末端殘基。將多肽鏈斷裂成肽段，并分離。測定各個肽段的氨基酸順序。確定肽段在多肽鏈中的次序。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。一般原則22第22頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)一般要求:a、樣品必需純（>97%以上）b、已知蛋白質(zhì)的分子量c、已知蛋白質(zhì)由幾個亞基組成23第23頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

(2)測定步驟A.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定24第24頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

(2)測定步驟

分析多肽鏈的N-末端和C-末端。多肽鏈N-端(amino-terminal)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定25第25頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基末端基氨基酸測定二硝基氟苯（DNFB）法26第26頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基末端基氨基酸測定丹磺酰氯法27第27頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Edman法。氨基末端基氨基酸測定苯異硫氰酸（PITC）法28第28頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月氨肽酶(aminopeptidases)是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。氨基末端基氨基酸測定氨肽酶法29第29頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月羧基末端基氨基酸測定羧基末端---肼解法30第30頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月羧肽酶(carboxypeptidase)是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解AA。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y.羧基末端基氨基酸測定羧基末端---羧肽酶法31第31頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月用LiBH4使C末端氨基酸還原成氨基醇，然后水解，測定氨基酸，即可知C末端氨基酸。羧基末端基氨基酸測定羧基末端---硼氫化鋰還原法-------------H2N-CH-CO-NH-CH-COOHH2N-CH-CO-NH-CH-CH2OHLiBH4|

R1|

R2|

R1|

R232第32頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）測定步驟B.多肽鏈的拆分。

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定33第33頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

(2)測定步驟B.多肽鏈的拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定34第34頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

(2)測定步驟C.二硫鍵的斷裂

還原法:-巰基乙醇(還原法)處理，使二硫鍵還原為巰基.SH-CH2-CH2-OH蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定35第35頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

(2)測定步驟

氧化法:應(yīng)用過甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定36第36頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）測定步驟D.測定每條肽鏈的氨基酸組成

根據(jù)蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定完全水解（徹底水解）不完全水解（部分水解）水解產(chǎn)物是aa混合物水解產(chǎn)物是各種大小不同的肽段和aa37第37頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月水解方法反應(yīng)條件產(chǎn)物優(yōu)點缺點酸水解6MHCl或4MH2SO4共煮20hrsL-aa不引起消旋Trp被破壞；一部分羥基aa(Ser,Thr)被分解；Asn和Gln的酰胺基被水解下來堿水解5MNaOH共煮20hrsL-aa和D-aa混合物不破壞Trp引起消旋；Arg脫氨基生成鳥氨酸酶水解生理溫度、pH肽段和氨基酸混合物不破壞aa不引起消旋酶解時間長Table1-238第38頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）測定步驟E.多肽鏈斷裂蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定多肽鏈斷裂法：酶解法和化學法39第39頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解

（2）測定步驟40第40頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Trypsin

：R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R241第41頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr時水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點糜蛋白酶42第42頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Pepsin：R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro水解受抑。肽鏈水解位點胃蛋白酶43第43頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。肽鏈水解位點嗜熱菌蛋白酶44第44頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(磷酸緩沖液);R1=Glu(碳酸氫銨緩沖液或醋酸緩沖液)精氨酸蛋白酶：R1=Arg肽鏈水解位點谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶45第45頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月化學法：可獲得較大的肽段溴化氰(Cyanogenbromide)水解法。羥胺（NH2OH）：多肽鏈的選擇性降解

（2）測定步驟46第46頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）測定步驟F.分離肽段測定每個肽段的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定47第47頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法。Edman氨基酸順序分析法苯乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸（PTH-aa）苯氨基硫甲酰氨基酸

（2）測定步驟48第48頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）測定步驟H.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置對角線法蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定49第49頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月對角線電泳（diagonaleletrophoresis）（Brown和Hartly）50第50頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月51第51頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段52第52頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）測定步驟蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定I.肽段在多肽鏈中的次序利用重疊肽，推出肽鏈的氨基酸順序。53第53頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月三、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

three-dimensionalstructure

54第54頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月構(gòu)型（configuration）是指在一個不對稱性的化合物中不對稱中心上的幾個原子或基團的空間排布方式。這種排列方式的改變會牽涉到共價鍵的形成或破壞，而與氫鍵無關(guān)，是一種兩維的變化。例如單糖的α-、β-型，氨基酸的L-、D-型都是構(gòu)型。構(gòu)象（conformation）是表示一個分子結(jié)構(gòu)中一切原子沿共價鍵（單鍵）轉(zhuǎn)動時而產(chǎn)生的不同空間排列，它通常與分子的不對稱性無關(guān)。這種排列的變化會涉及到氫鍵等次級鍵的形成和破壞，而不改變共價鍵，這是三維空間的變化，如多肽及蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)即屬于構(gòu)象。55第55頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）多肽鏈折疊的空間限制Fig.

Limitedrotationcanoccuraroundtwoofthethreetypesofbondsinapolypeptidechain.1.肽平面（酰胺平面、肽單位、肽基）56第56頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月多肽鏈的構(gòu)象可用肽基間的兩面角來描述。繞C

–N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱（角），繞C

–C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱（角）。多肽鏈的所有構(gòu)象都可以用、兩個構(gòu)象角來描述。這兩個角（和

）決定了相鄰兩個肽平面的相對位置。2.

C的二面角（dihedralangle）

57第57頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Fig1-29.Thepeptidebondplanesarejoinedbythetetrahedralbondsofthe-carbon.Theconformationshowncorrespondsto=+180°，=+180°.58第58頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月3.

可允許的角和角

拉氏構(gòu)象圖(Ramachandranplot)：

根據(jù)非鍵合原子之間的最小接觸距離確定二面角（，

）的允許范圍。59第59頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

（ProteinSecondarystructure)概念：蛋白質(zhì)分子中主鏈折疊產(chǎn)生的、由氫鍵維系的、有規(guī)則的構(gòu)象。二級結(jié)構(gòu)的類型：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲幾種形式。維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要化學鍵是氫鍵。

60第60頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.-螺旋（-helix）Φ=-57°，Ψ=-47°；FigFourdifferentgraphicrepresentationsofthe-helix.0.54nm0.15nm結(jié)構(gòu)要點61第61頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月影響-螺旋形成的因素⑴極大的側(cè)鏈基團（存在空間位阻）；⑵連續(xù)存在的側(cè)鏈帶有相同電荷的氨基酸殘基（同種電荷的互斥效應(yīng)）；⑶有Pro存在時，（不能形成氫鍵），因此將中斷α螺旋。⑷有Gly，因為側(cè)鏈過于簡單，而導致構(gòu)象太“柔順”。62第62頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

其他類型的螺旋：?

310-螺旋:?π-螺旋（4.416—螺旋）:

63第63頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月2．β-折疊(β-sheet):

兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈，側(cè)向聚集，相鄰肽鏈上的C=O與NH形成有規(guī)則的氫鍵，所有肽鍵都參與氫鍵形成，方向與肽鏈長軸垂直。有平行（所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向）；反平行（肽鏈的極性一順一倒，N端間隔相同）。64第64頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月Fig“Apleatedsheet”ofpaperwithanantiparallel-sheetdrawnonit.

-折疊股65第65頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月3．β-轉(zhuǎn)角(β–Turn)

多肽鏈180°回折部分所

形成的一種二級結(jié)構(gòu)，常

由４個氨基酸殘基組成，

第二個殘基常為脯氨酸。

第一個aa殘基的羰基氧與

第四個aa殘基的酰胺氫之

間形成氫鍵。66第66頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月R在同一側(cè)R在相對側(cè)第5次課結(jié)束67第67頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月4．無規(guī)卷曲（Randomcoil)無規(guī)卷曲：無規(guī)卷曲在球狀蛋白中含量較高，對外界理化因子敏感，與生物活性有關(guān)。68第68頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月69第69頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)

Supersecondarystructure在球狀蛋白質(zhì)中，若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組和在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則、在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體，充當三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)至三級結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象層次。有三種基本形式：αα，βαβ和ββ。70第70頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域(domain)結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)和超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步繞曲折疊成緊密的近似球狀的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能。通常都是幾個超二級結(jié)構(gòu)單元的組合。對于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基，結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)意思相同，即這類蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域（singledomain)；較大的蛋白質(zhì)含多個結(jié)構(gòu)域(multidomain).71第71頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月兩個結(jié)構(gòu)域彼此很不相同72第72頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

Tertiarystructure蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈的不同區(qū)段的側(cè)鏈基團相互作用在空間進一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維結(jié)構(gòu),是球狀分子特有的結(jié)構(gòu)。指多肽鏈中所有的原子或基團的空間排列。73第73頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月S-SbondS-SbondActivesite蝦紅素(

Astacin)74第74頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月維持三級結(jié)構(gòu)的作用力：主要有氫鍵、疏水相互作用、離子鍵(鹽鍵)、范德華力等。尤其是疏水相互作用。75第75頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月

這些弱的相互作用（或稱非共價鍵，或次級鍵），是蛋白質(zhì)分子的主鏈和側(cè)鏈上的極性、非極性、離子基團相互作用形成的。

76第76頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月圖4－6維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的化學鍵CH3CH31．氫鍵（HydrogenBond）兩個重要的特征：方向性飽和性77第77頁，課件共88頁，創(chuàng)作于2023年2月圖4