植物組織和器官培養(yǎng)

植物組織和器官培養(yǎng)第1頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)植物脫毒與快速繁殖快繁（rapidpropagation）或微繁（micropropagation）技術(shù)：利用組培進(jìn)行快速營養(yǎng)繁殖的技術(shù)?？旆钡膽?yīng)用：1、雜合植物材料的大量繁殖。2、脫毒種苗生產(chǎn)3、加速繁殖數(shù)量有限的特殊種質(zhì)材料4、單獨(dú)繁殖雄株或雌株第2頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月快繁的發(fā)展史1☆20世紀(jì)40年代，中國羅士韋世界上最早研究莖尖培養(yǎng)，之后Ball由莖尖獲得植株☆1952，Morel和Martin通過莖尖培養(yǎng)獲得無病毒大麗花☆1960，Morel獲得無病毒蘭花此后在歐美國家出現(xiàn)以莖尖培養(yǎng)為基礎(chǔ)的蘭花、馬鈴薯和草莓等植物的脫毒試管苗工廠，形成最早的植物細(xì)胞工程產(chǎn)業(yè)。第3頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月快繁的發(fā)展史2☆我國脫毒快繁產(chǎn)業(yè)：

◆20世紀(jì)70年代，羅士韋和崔瀓，率先開展經(jīng)濟(jì)植物脫毒莖尖培養(yǎng)研究。

◆中科院植物所陶國清、陳維倫分別建立了馬鈴薯和蘋果的莖尖培養(yǎng)技術(shù)

◆中科院上海植物生理研究所王熊等開展了蘭花和無籽西瓜的快繁研究，并建立了甘蔗的組織育苗技術(shù)。在以下植物上取得重要進(jìn)展：香蕉、馬鈴薯、甘蔗、木薯、香莢蘭、草莓、柑橘及其砧木、蘋果及其砧木、葡萄、造林樹種和經(jīng)濟(jì)林木、花卉及觀賞植物第4頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月一、植物快繁的途徑與方法技術(shù)★利用芽和莖尖培養(yǎng)進(jìn)行快繁

選取只帶1～2個(gè)葉原基的生長點(diǎn)進(jìn)行脫毒。

雙子葉植物常用MS培養(yǎng)基，單子葉植物常用B5培養(yǎng)基。

經(jīng)驗(yàn)：大量元素減半，不加肌醇并將VB1提高至1mg/L的1/2MS適合于大多數(shù)植物的莖尖培養(yǎng)。WPM（WoodPlantMedium）：專為木本植物莖尖培養(yǎng)設(shè)計(jì)第5頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月激素的使用細(xì)胞分裂素：打破芽的休眠和克服頂端優(yōu)勢，促使形成叢生芽。最常用6-BA，KT等，0.5~2mg/L。生長素：低濃度，促進(jìn)芽生長。IAA、NAA、IBA等，0.1~1mg/L。赤霉素：低濃度，促進(jìn)芽伸長。光照有利于大多數(shù)植物莖尖培養(yǎng)和芽的分化與增殖。但塊莖和鱗莖的分化和增殖需要黑暗條件。第6頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月外植體褐變褐變原因:植物中含有多酚，創(chuàng)傷會(huì)激活多酚氧化酶，將多酚氧化為棕褐色的醌類，使得外植體切口發(fā)生褐變，并滲透入培養(yǎng)基，嚴(yán)重影響培養(yǎng)物的生長和分化，甚至致其死亡。影響褐變因素：木本植物外植體易褐化，尤其成年樹；培養(yǎng)基中過高濃度的無機(jī)鹽和肌醇會(huì)加劇褐變；6-BA和KT有誘導(dǎo)褐化作用；強(qiáng)光和高溫會(huì)促進(jìn)褐化。第7頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月外植體褐變防治1、選取酚類含量低的實(shí)驗(yàn)材料2、選擇無機(jī)鹽含量低，不加肌醇的培養(yǎng)基3、在弱光線或黑暗條件下培養(yǎng)4、培養(yǎng)基中加入抗氧化劑：Vc、檸檬酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。5、在培養(yǎng)基中加入0.5%~1%活性炭，吸附醌類，注意同時(shí)提高培養(yǎng)基中激素濃度。6、不斷地更換新培養(yǎng)基第8頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月腋芽的生長與增殖★一般使用細(xì)胞分裂素打破頂端優(yōu)勢，促使腋芽萌動(dòng)?！镯敹藘?yōu)勢不被細(xì)胞分裂素打破的植物，如葡萄，可用切段法繁殖?！镆秆吭鲋车淖畲髢?yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物不易變異，可長時(shí)間大量提供遺傳同質(zhì)的試管苗★低溫處理有時(shí)有促進(jìn)腋芽萌動(dòng)和增殖作用第9頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月誘導(dǎo)生根☆有些植物在無激素基本培養(yǎng)基上即可生根☆木本植物則在生根培養(yǎng)基上才能生根，常用生長素：NAAIBAIAA，0.1~10mg/L☆經(jīng)驗(yàn)：1/2MS、White、WPM、Anderson培養(yǎng)基可用于試管苗生根。銨態(tài)氮含量低的N6、B5利于生根。蔗糖濃度降低，可促進(jìn)試管苗自養(yǎng)。第10頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月移栽試管苗先在強(qiáng)光和較低溫度下生長一段時(shí)間，根剛長出時(shí)移栽最合適。先在溫室過渡培養(yǎng)。第11頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月利用植株再生技術(shù)進(jìn)行快繁再生植株方式3種：1、外植體直接產(chǎn)生不定芽2、外植體產(chǎn)生愈傷，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后產(chǎn)生胚狀體，再生植株3、外植體產(chǎn)生愈傷，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后分化芽，再生植株。第12頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月外植體直接產(chǎn)生不定芽不定芽：頂芽和腋芽以外任何其它器官或組織產(chǎn)生的芽不定芽形成的個(gè)體形態(tài)和遺傳相同。第13頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織產(chǎn)生胚狀體※誘導(dǎo)胚狀體形成時(shí)，一般使用胚、分生組織和花藥組織作為外植體?！日T導(dǎo)外植體輕微的愈傷化，再轉(zhuǎn)移到胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上?！p子葉植物：MS適合※單子葉，尤其禾谷類：附加1400～2000mg/L脯氨酸的N6基本培養(yǎng)基比較理想?！?,4-D非常重要：高濃度誘導(dǎo)愈傷，低濃度（或不加）誘導(dǎo)胚狀體。優(yōu)點(diǎn)：繁殖系數(shù)高，雙極性，無需生根?？刂坪门郀铙w發(fā)生和生長的同步性，誘導(dǎo)休眠，制造人工種子是最理想的快繁方法。缺點(diǎn)：會(huì)有少量變異株第14頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織分化芽和植株最嚴(yán)重問題：細(xì)胞在遺傳上的不穩(wěn)定性，再生植株較高頻率的無性系變異另一缺點(diǎn)：隨著繼代，植株再生能力下降直至喪失。盡量避免這種方法。第15頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月二、組培脫毒快繁技術(shù)莖尖脫毒原理：病毒通過植物的維管束和細(xì)胞壁上的胞間連絲擴(kuò)散到所有的組織和器官，但植物莖尖分生組織由分生細(xì)胞構(gòu)成，分生區(qū)域內(nèi)無維管束，細(xì)胞壁的胞間連絲也不發(fā)達(dá)，病毒很難進(jìn)入，所以生長點(diǎn)往往不含病毒或含極少量病毒，因此采用莖尖可進(jìn)行脫毒快繁。第16頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)★一般選取帶1～2個(gè)葉原基的頂端分生組織培養(yǎng)?！锷L素一般采用NAA或IAA，應(yīng)避免采用使莖尖愈傷組織化的2,4-D★無病毒苗只是相對(duì)：無特定病毒種苗或無特定病原菌種苗第17頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月高溫和低溫處理脫毒技術(shù)高溫脫毒：病毒和植物細(xì)胞對(duì)高溫耐受力不同。熱處理脫毒又稱為溫?zé)岑煼ǎ╰hermotherapy），分溫湯浸漬處理和熱風(fēng)處理兩種。莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱風(fēng)處理可取得較理想的脫毒效果。低溫脫毒也稱冷凍法（cryotherapy)第18頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月化學(xué)處理脫毒2-硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、virazole（病毒唑）和一些蛋白質(zhì)與核酸合成的抑制劑，能不同程度地抑制病毒復(fù)制，處理離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體有相當(dāng)好的結(jié)果。第19頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物病毒的鑒定病毒鑒定的必要性：由莖尖或愈傷分化的植株并不都是無病毒的，在培養(yǎng)中許多病毒有逐漸恢復(fù)的特點(diǎn)，所以最初10個(gè)月，要定期重復(fù)進(jìn)行病毒的鑒定。另外無毒植株仍可能染毒，要進(jìn)行抽查。第20頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病毒鑒定方法11、指示植物法：利用病毒在已感病的指示植物上出現(xiàn)癥狀的特征作為鑒別病毒的依據(jù)。

1920Holmes首創(chuàng)2、抗血清鑒定法植物病毒是由核酸與蛋白組成的核蛋白，是一種抗原，注射到動(dòng)物體內(nèi)即產(chǎn)生抗體?？贵w存在于血清中即為抗血清（antiserum)。這是目前快速定量測定病毒的常規(guī)診斷方法。第21頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病毒鑒定方法23、酶聯(lián)免疫法ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay—

將抗原固定在支持物上，加入待檢血清，然后加入酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）標(biāo)記的抗體，使待檢血清與對(duì)應(yīng)抗原的特異性抗體結(jié)合，最后用分光光度計(jì)作出診斷。4、電鏡檢查法ISEMimmunosorbentelectronmicroscope,靈敏度高，可定量測定植物粗提液中病毒5、RT-PCR方法ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction

將寄主的總RNA與cDNA合成的試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表達(dá)，從而確定病毒是否存在。第22頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)花藥及花粉培養(yǎng)我國花藥培養(yǎng)研究始于1972年。在花藥培養(yǎng)的基礎(chǔ)研究方面，我國學(xué)者做出了一些公認(rèn)的研究成果：1、朱至清發(fā)現(xiàn)低銨離子濃度和過濾消毒的單糖顯著促進(jìn)禾谷類花粉胚的發(fā)育，建立了N6和改良N6培養(yǎng)基2、歐陽俊聞確立單核中期的小麥花粉最適于產(chǎn)生花粉植株，較高的培養(yǎng)溫度有利于花粉綠苗形成3、衛(wèi)志明首次指出大麥遭受碳饑餓可大幅度提高花粉胚的產(chǎn)率。4、孫敬三發(fā)現(xiàn)花粉中質(zhì)體DNA降解引起的質(zhì)體RNA和蛋白質(zhì)的匱乏是白化苗形成的原因。5、煙草“單育一號(hào)”水稻“單豐一號(hào)”第23頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月影響花藥培養(yǎng)成功率的因素11、供體的基因型2、供體植株的生理狀況3、花粉的發(fā)育時(shí)期

單核中晚期至雙核早期的花粉最易形成花粉胚或花粉愈傷4、材料的預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)低溫、離心、乙烯利、甘露醇預(yù)處理；高溫預(yù)培養(yǎng)第24頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月影響花藥培養(yǎng)成功率的因素25、培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基；N6培養(yǎng)基附加600～1000mg/L脯氨酸6、培養(yǎng)方式液體培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)條件培養(yǎng)基：已經(jīng)預(yù)先培養(yǎng)過花藥（或其它離體細(xì)胞）的液體培養(yǎng)基7、培養(yǎng)條件：主要調(diào)控溫度（短期高溫培養(yǎng)）和光照（先暗后光）第25頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月游離小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體游離小孢子培養(yǎng)（isolatedmicrosporeculture），又花粉培養(yǎng)（pollenculture）：把小孢子從花藥中分離出來，進(jìn)行人工培養(yǎng)與植物花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：1、排除了花藥壁和絨氈層的影響，便于分析研究結(jié)果2、需要的器皿和培養(yǎng)空間較小，大大提高了生產(chǎn)單倍體的效率3、小孢子本身也可能成為基因工程的受體第26頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月小孢子的分離方法擠壓法、散落法和器械法要求小孢子達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)：1、成活率較高，發(fā)育期整齊2、小孢子達(dá)到一定數(shù)量3、無菌、無雜質(zhì)第27頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

單倍體誘導(dǎo)與單倍體育種單倍體植株：植物學(xué)上通常把具有配子體染色體數(shù)目的孢子體叫做單倍體植株多倍單倍體：有些物種由兩個(gè)以上物種雜交形成，細(xì)胞中包含兩個(gè)以上染色體組，稱為多倍二倍體，其單倍體為多倍單倍體，習(xí)慣上仍稱作單倍體單倍體：矮小，不育第28頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月單倍體植物在遺傳育種上的價(jià)值1、利用單倍體植物控制雜種分離，加快常規(guī)育種速度2、提高常規(guī)育種的選擇效率3、利用H系進(jìn)行基因定位，繪制遺傳圖第29頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)植物胚胎培養(yǎng)被子植物雙受精（doublefertilization):

二倍體合子三倍體胚乳幼胚培養(yǎng):Hanning（1904）；Laibach（1925）最先付諸應(yīng)用的植物細(xì)胞工程技術(shù)：20世紀(jì)20年代建立的幼胚培養(yǎng)和胚胎拯救（embryorescue)技術(shù)第30頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月中國學(xué)者在裸子植物胚胎培養(yǎng)方面的工作1934清華的李繼侗和沈同發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳提取物可刺激離體胚生長1941VanOverbeek發(fā)現(xiàn)椰乳對(duì)幼胚發(fā)育的促進(jìn)作用1943羅士韋和王伏雄在Science發(fā)文章，離體培養(yǎng)云南松和云南杉幼胚成功。第31頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月一、胚胎培養(yǎng)一、成熟胚培養(yǎng)☆盾片在胚吸收營養(yǎng)上有重要作用☆胚胎培養(yǎng)可以解除種皮抑制作用☆?MS適用于多種植物成熟胚培養(yǎng)成功例子：雜種桃成熟胚培養(yǎng)與新品種培育第32頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月植物胚胎的發(fā)育時(shí)期

二、幼胚培養(yǎng)幼胚在胚珠中異養(yǎng)，離體培養(yǎng)必須提供足夠的營養(yǎng)和適宜的條件。雙子葉植物胚胎的發(fā)育時(shí)期：合子（zygote），二細(xì)胞原胚（two-celledproembryo），球形胚（globularembryo），心形胚（heart-shapedembryo），魚雷形胚（torpedo-shapedembryo），拐杖形胚（walking-stick-shapedembryo），倒U形胚（invertedU-shapedembryo），成熟胚（matureembryo）

心形胚以后的雙子葉胚較易培養(yǎng)，球形胚很難培養(yǎng)。單子葉植物胚胎的發(fā)育時(shí)期與雙子葉植物有很大不同。

第33頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月幼胚的培養(yǎng)☆常用培養(yǎng)基：Nitsch、MS、1/2MS