新概念疫苗與基因免疫

新概念疫苗與基因免疫第1頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫機制特異性免疫非特異性免疫(固有免疫:皮膚等屏障、吞噬細胞、補體、溶菌酶等)自然的人工的自然主動免疫自然被動免疫人工主動免疫人工被動免疫疫苗第2頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一、傳統(tǒng)疫苗的研究及應用疫苗——凡具有免疫原性、接種于機體可產(chǎn)生特異性主動免疫力，可抵御感染等疾病的發(fā)生或流行，統(tǒng)稱為疫苗。第1節(jié)疫苗新概念及新概念疫苗

細菌制備的制劑稱為“菌苗”；把病毒及立克氏體等制備的制劑稱為“疫苗”；以細菌代謝產(chǎn)物——毒素制備的制劑稱為“類毒素”。能誘發(fā)自動免疫的制劑統(tǒng)稱為“疫苗”第3頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月減毒活疫苗是指通過各種手段降低病原體的毒力，并以降低毒力后的病原體做疫苗，如脊髓灰質炎疫苗(糖丸)及BCG等；復制型重組疫苗又稱載體疫苗(vectorvaccine)，是將保護型的靶抗原編碼基因通過細胞內重組或體外DNA操作等方式插入無毒、弱毒活或減毒的病毒(痘苗病毒、腺病毒等)或細菌(傷寒桿菌疫苗株、BCG等)中；第5頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月滅活疫苗是毒性病原體經(jīng)滅活后使其喪失感染性，但仍保留免疫原性的疫苗。這類疫苗株不能在體內復制或繁殖。比如最近開發(fā)的H1N1甲流滅活疫苗，豬鏈球菌畜用滅活疫苗等；純化蛋白亞單位疫苗是分離、純化病原體中一種或幾種蛋白為靶抗原(有保護保用的抗原)，誘導機體產(chǎn)生中和性抗體,如HBV疫苗；重組亞單位疫苗是用重組DNA技術，將編碼靶抗原的基因插入表達載體中，在大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞或昆蟲細胞中表達這些抗原，經(jīng)純化后獲得的亞單位蛋白結構；第6頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月合成肽疫苗是用固相合成法合成可誘生特異性免疫反應的多肽片段(抗原表位),用作疫苗的靶抗原成分；抗獨特型疫苗(anti-idiotypevaccine)根據(jù)抗原和抗獨特型均能與獨特型(抗體)結合，因此認為抗獨特型含有與抗原相似的氨基酸序列或空間構型(即內在影像)，所以抗獨特型可以代替抗原作為疫苗。尤其是在抗原獲得比較困難時，這種抗獨特型疫苗就很有價值。第7頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月疫苗的“活”或“死”決定了其誘生免疫應答的類型▽死疫苗不能有效地進行MHC-I類抗原加工呈遞,故死疫苗一般不會誘導有效的CMI；▽活疫苗可有效地進行MHC-I類抗原呈遞，誘生細胞免疫。但其常受到個體條件的限制；活疫苗中常含有潛在致病性的生物活性成分；活疫苗的貯存和運輸?shù)某杀径驾^為昂貴。

第9頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月二、疫苗新概念傳統(tǒng)疫苗新型疫苗成分不同死疫苗/減毒活疫苗/重組亞單位疫苗編碼抗原蛋白核酸或激發(fā)免疫應答的細胞機制不同中和性抗體保護性抗體、細胞免疫應答作用不同預防作用預防和治療(治療性疫苗)疫苗(vaccine)最初是指接種牛痘苗預防天花的痘苗，其名來源于拉丁語中的雌牛(vacca)。第10頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月三、新概念疫苗核酸疫苗T細胞疫苗樹突狀細胞疫苗第11頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月疫苗的三次革命

Pasteur在100年以前所開創(chuàng)的以炭疽和狂犬病疫苗為代表的第一次疫苗革命在技術上是細胞水平的研究和開發(fā)；

從20世紀70年代的中期開始，形成了以基因工程制備的乙型肝炎表面抗原為代表的分子水平的第二次疫苗革命；上一世紀90年代初開始興起的DNA疫苗被稱為第三次疫苗革命。第12頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)核酸疫苗核酸疫苗(nucleicacidvaccine)——又稱核酸免疫或基因免疫,是將含有編碼特定外源抗原蛋白質的基因序列克隆到合適的質粒載體上，制備成核酸表達載體。通過肌肉注射等方法將其導入機體內，通過宿主細胞的轉錄系統(tǒng)合成抗原蛋白質，表達產(chǎn)物與MHC結合而被遞呈，從而激發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對外源蛋白質的特異性免疫應答反應，即刺激機體產(chǎn)生相應的抗體和細胞毒性T淋巴細胞，分別介導體液免疫應答和細胞免疫應答。

第13頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)T細胞疫苗(TCellVaccine,TCV)用化學或物理方法滅活的致病性T細胞，其失去致病能力，但保持了致病性T細胞的免疫特征。TCV免疫動物后能夠誘導機體產(chǎn)生針對致病性T細胞的免疫應答?？梢韵驕p輕這些細胞的致病作用或反應能力，表現(xiàn)為對自身免疫性疾病的防治作用和誘導同種移植物質延長存活。TCV是指將T細胞或體外T細胞表位多肽刺激產(chǎn)生的T細胞作為疫苗接種。近年來，將依據(jù)MHCI類分子特異的多肽結合基序(MHCbindingmotif)合成的多肽，在體外誘導產(chǎn)生抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，用于治療病毒性疾病。第14頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1.治療某些自身免疫疾病自身反應性T細胞——自身免疫疾病

滅活自身反應性T細胞——接種機體自身反應性T細胞——自身免疫疾病

小鼠變態(tài)反應性腦脊髓炎；人類多發(fā)性硬化癥第15頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.TCV與移植排斥反應

同種器官組織移植后，受體免疫系統(tǒng)識別供體MHC抗原，引起細胞免疫應答，觸發(fā)了同種排斥反應，其中T細胞發(fā)揮著重要作用。如果把同種反應性T細胞看作是致病性T細胞，制備成TCV并接種于動物后，可以誘導抗原特異性的同種免疫耐受或免疫反應低下。第16頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.治療某些病毒性疾病病毒感染的清除：抗體+CTL過繼免疫治療如LAK細胞、CD3-AK細胞(CD3McAbactivatedkillercells)均為非特異殺傷細胞，靶向性差；

直接接種單個或多個含CTL表位的多肽(多肽疫苗)，雖然可誘導機體產(chǎn)生特異性CTL應答，但常常滴度不高。較短的TL多肽表位易被血清蛋白酶所降解第17頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月CTL多肽疫苗CTL應答弱較短的TL多肽更易被血清蛋白酶所降解將幾個多肽交聯(lián)？加大抗原肽的量？T細胞疫苗是用多肽在體外誘生產(chǎn)生特異性CTL，后者被克隆、擴增、篩選和鑒定后，僅將MHCI類限制的CD8+T細胞輸入機體，誘導細胞免疫應答。

第18頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月TCV的可能機制：

1.抗獨特型T細胞的作用(抗克隆型的調節(jié)性T細胞):可通過識別靶細胞TCR的克隆型決定簇來調節(jié)自身反應性T細胞。2.抗活化型T細胞的作用：活化T細胞標記：粘附分子、ergotype分子等；活化T細胞作為抗原遞呈細胞，誘導出抗活化型T細胞(anti-activatedTcell)

：該類細胞介導的抵抗作用弱，持續(xù)時間短，對靶細胞的殺傷作用不受MHC限制。4.Th1/Th2轉換的作用。3.抗活化T細胞抗體的作用；TCV免疫調節(jié)中的非特異性因素；以及對其作用機理的進一步闡明。？第19頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)樹突狀細胞疫苗DC是專職抗原遞呈細胞，能有效地將抗原遞呈給T淋巴細胞，從而誘導CTL活化。荷載抗原的DC具有疫苗功能，故稱樹突狀細胞疫苗。

荷載抗原：病毒抗原、HLA限制的CTL表位基因，也可以是腫瘤細胞，還可以是編碼腫瘤抗原的基因。2010年5月：第一個癌癥治療疫苗——前列腺癌疫苗(DC疫苗)第20頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月用抗原或抗原多肽體外沖擊致敏DC，然后將之回輸或免疫接種荷瘤宿主或帶病毒特異性抗原的宿主，進行免疫治療；利用DC與腫瘤細胞融合成為新型帶有DC功能及腫瘤特異抗原的融合細胞瘤苗；利用病毒載體等將帶有腫瘤或病毒特異抗原的編碼基因轉染DC，使之DC細胞內持續(xù)表達相應特異抗原，誘導產(chǎn)生特異性抗腫瘤或抗病毒免疫反應。常用的研究方法：第21頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月四、未來疫苗學的發(fā)展方向及展望

(一)針對感染性疾病的新疫苗1.核酸疫苗的發(fā)展：

如何提高其在人體誘生特異性免疫應答的效率？2.治療性疫苗的發(fā)展

：

能限制或根除已經(jīng)呈現(xiàn)并確立的感染源或疾病。部分依賴于DNA(即基因疫苗或核酸疫苗)。第22頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)針對非感染性疾病的新疫苗1.癌癥：

特異性腫瘤抗原——免疫反應，特異性地削減腫瘤細胞：黑色素瘤gp100基因和結腸直腸癌CEA-B7.1基因等。2.自身免疫性疾?。侯愶L濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、食物過敏、I型糖尿病、阿茲海默病以及對古柯堿和尼古丁上癮的疫苗。第23頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)新的疫苗傳遞技術1.透皮性免疫預防；2.轉基因可食性植物遞送疫苗；3.可控性遞送儲存系統(tǒng)。疫苗抗原包裹于由生物降解性聚合物如多糖多乳酸組成的微球體中，可定位于免疫系統(tǒng)中的多種細胞或可在注射位置形成儲存場所，允許抗原隨時間緩慢釋放。第24頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概述五、基因免疫中目的基因的來源六、基因免疫的注射途徑和方法二、基因免疫可能的分子機制九、常用研究方法舉例第2節(jié)基因免疫三、基因免疫的載體結構七、免疫保護效果評價八、核酸疫苗安全性評價四、CpG的免疫佐劑效應在基因免疫中的作用

第25頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概述1.什么是基因免疫？基因免疫(geneimmunization)又稱DNA免疫(DNAimmunization)、核酸疫苗(polynucleotidevaccine)、DNA疫苗、體細胞轉基因免疫(somatictransgeneimmunization)、遺傳免疫(geneticimmunization)。指將靶抗原編碼基因置于真核表達調控元件的調控下，將該重組質粒DNA直接進行動物體內接種，并以與自然感染類似的方式呈遞抗原，誘生特異性體液和細胞免疫應答的新理論和技術。又稱為裸DNA免疫(nakedDNAimmunization)。第26頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月DNAVaccinesTheThirdVaccineRevolutionPlasmidvaccinePlasmidyieldantigenicproteinantigenicpeptidesMemoryTcellActivatedcytotoxicTcellMemoryBcellAntibodiescellularimmunityhumoralimmunity第27頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月基因免疫不僅已廣泛地應用于抗病毒、細菌、真菌、寄生蟲等抗感染免疫中，同時也發(fā)現(xiàn)在腫瘤免疫及自身免疫性疾病中起重要作用；常規(guī)基因免疫：將靶抗原編碼基因置于常規(guī)的病毒啟動子(可以在真核細胞內啟動表達)、增強子等調控元件的調控下，經(jīng)肌肉接種免疫；目前具有特異性靶向性、高表達水平、表達可調節(jié)性和選擇性誘導某一特定類型免疫應答的新一代基因免疫。第29頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.基因免疫系統(tǒng)的建立▽20世紀90年代初期建立，質粒DNA可在體內肌細胞中以環(huán)狀、非整合、非復制狀態(tài)存在達1個月之久，而轉基因產(chǎn)物的活性在體內可檢測到達2個月之久。美國的Wolff及Vical于1989年偶然發(fā)現(xiàn):第30頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月▽1992年，Tang等，首次證實編碼抗原基因的質粒DNA注入小鼠體內不僅可表達相應的轉基因產(chǎn)物，同時還可誘生基因產(chǎn)物特異的抗體應答。將CMV啟動子表達的人生長激素(hGH)基因以基因槍注射的方式注入小鼠耳皮內，3~6周在小鼠體內可測到高水平的抗hGH特異性抗體應答。這一研究成為開創(chuàng)基因免疫的先驅工作第31頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月▽基因免疫成了抗感染免疫等領域的新的研究熱點?；蛎庖呙馊チ朔爆嵉牡鞍准兓襟E和免疫佐劑的輔助；基因在體內的表達及誘生免疫的過程，模擬了自然狀態(tài)下機體感染外源病原生物后，其在體內表達抗原及誘生免疫的過程。第32頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月①基因疫苗可在體內合成與自然感染狀態(tài)下表達的蛋白具有相同的構象和翻譯加工方式的蛋白抗原；

②內源合成的蛋白可有效地被MHC-I類分子呈遞，模擬病原體繁殖后在體內表達抗原，誘生CTL的過程；

③轉基因在體內細胞表達的產(chǎn)物可在細胞裂解或凋亡時被釋放至細胞外，或與凋亡細胞一同為APC攝取，被MHCII分子呈遞。3.基因免疫的優(yōu)勢第33頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月④重組質粒DNA在宿主體內存在時間長，產(chǎn)生持久免疫，能刺激黏膜免疫，誘導免疫記憶；⑤基因免疫采用的質粒DNA沒有毒力回復的危險，較活疫苗更為安全；

⑥同一個質?？赏ㄟ^患聯(lián)或并聯(lián)的方式克隆多個目的基因，可實現(xiàn)一種疫苗預防多種疾病的目的；

第34頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月⑦DNA的制備、貯存極為方便和廉價，也更易進行基因水平上的操作和改造，從而更有利于制備多抗原基因疫苗；⑧基因免疫可能在一些特殊領域里有常規(guī)疫苗所不具備的應用價值，如新生兒免疫。第35頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.基因免疫的應用前景

由于基因免疫操作上簡便、易行以及誘導免疫應答的相對高效性基因免疫已在抗感染免疫及非感染性疾病如腫瘤、自身免疫性疾病中廣泛應用。第36頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基因免疫可能的分子機制▼基因被注入肌肉組織或皮下后，是如何被細胞攝取?▼在細胞內表達的蛋白是如何遞呈的?▼微量抗原[pg(10-12g)至ng(10-9g)]，怎樣誘導出宿主的免疫應答?第37頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)質粒DNA直接轉染體細胞肌細胞結構特點:多核細胞、肌織網(wǎng)；T小管系統(tǒng)——細胞外液并能伸到細胞內部，伸入到細胞內部的肌膜為漿膜小體(caveolae)

。

▼在電鏡下是肌膜凹陷形成的小泡狀結構▼外源基因的內化是由漿膜小體介導的胞飲過程第38頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA被攝入肌細胞過程：▼DNA受體蛋白經(jīng)由糖基磷脂酰肌醇(GPI)固定在漿膜小體表面并聚集成叢；▼DNA與受體結合后，漿膜小體在開口處閉合并脫離肌膜；▼DNA與受體在漿膜小體內分離，沿濃度梯度經(jīng)漿膜小體到達胞漿(通過XX載體？)。第39頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)基因免疫中抗原呈遞的分子機制第40頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月專職APC:巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞。第42頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1.MHCII類應答的機制：質粒DNA在轉染的靶細胞中表達的蛋白抗原通過細胞分泌或細胞裂解的途徑釋放，為APC所攝取，并與MHCII類分子在晚期內體內結合，被呈遞于APC表面。激活Th細胞Th1：IL-2/IFN-r，參與CMITh2：IL-4/IL-10，輔助HI第43頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月MHCII類應答IngestionSecretionLysedrelease輸入淋巴管生發(fā)中心第44頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月ThThAPCThBTh2AntigenicpeptideExpressingMHC-IImoleculeSpecificantibody第45頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.MHCI類應答的機制：MuscleinjectionEndogenousProteinantigen內源性途徑CTLCD8+MHC-I第46頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月BCRCTLCD8+MHC-ICD4+MHC-IITh外源性途徑EndogenouspeptideExdogenousprotein第47頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基因疫苗的載體結構1.多克隆位點(multiplecloningsite,MCS)；如BamHI:GGATCCCCTAGG

MCS中的酶切位點必須是唯一的第48頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.選擇的標記基因▽Amp抗性基因：用Amp篩選E.coli▽Neomycin抗性基因：用G418等篩選穩(wěn)定轉染細胞株。第49頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.啟動原核和真核的復制、轉錄及表達的元件(1)復制起始點▽f1

ori(f1噬菌體復制起始點)

pUC

ori(來自pBR322質粒的復制起始位點)----E.coli復制▽SV40

ori(SV40病毒復制起始點)，------真核細胞中復制第50頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.啟動原核和真核的復制、轉錄及表達的元件(2)啟動子/增強子

▽T7(噬菌體)啟動子

----啟動原核表達Amp抗性;▽CMV(巨細胞病毒)啟動子

----啟動真核表達:(目的基因/neomycin抗性)

第51頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.啟動原核和真核的復制、轉錄及表達的元件(3)多聚腺苷poly(A)加尾終止信號poly(A)----復制終止信號▽BGHpA—牛生長激素poly(A)；▽SV40p(A)—即SV40病毒poly(A)。第52頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月四、CpG的免疫佐劑效應在基因免疫中的作用細菌DNA可激活B細胞、NK細胞、單核細胞等分泌細胞因子，而哺乳動物DNA則無此作用。細菌DNA中包含許多以高頻率出現(xiàn)的非甲基化CpG寡核苷酸序列，由5’-嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶-3’(如AACGCTCGACC寡核苷酸)。CpG具有免疫佐劑作用，可激活多種細胞分泌細胞因子。CpG在細菌基因組和質粒中的頻率為1/16；而脊椎動物為1/50;甲基化：原核甲基化不足5%；真核甲基化達70-80%。第53頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月CpG具有免疫佐劑作用----------刺激分泌細胞因子必須與抗原共同注射于相同的部位才表現(xiàn)出免疫輔助作用CpG序列=ISS序列胞嘧啶核苷磷酸鳥苷(Immunostimulatorysequences,ISS)第54頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月五、基因免疫中目的基因的來源

(一)完整抗原編碼基因的基因免疫；(二)以抗原表位為基礎的基因免疫；(三)表達文庫(expressionlibrary)基因免疫。第55頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)完整抗原編碼基因的基因免疫已知的病原微生物中抗原性較強的蛋白抗原均可作為基因免疫的靶抗原,例如流感病毒血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NP)、HIV包膜蛋白gp120、結核桿菌的Ag85B等;第56頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原編碼基因:

已知的病原微生物中抗原性較強的蛋白抗原PCRencoded第57頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月完整抗原基因免疫后在體內可有效地模擬活疫苗的作用。與重組疫苗或亞單位疫苗顯著不同的是：轉基因在宿主細胞中可合成與天然抗原有類似空間構象及糖基化方式的蛋白，并與細胞內MHCI和II類分子結合，呈遞于APC表面，從而誘生有效的細胞免疫應答和可識別構象依賴性抗原表位的抗體。第58頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月完整抗原基因免疫對一些高度變異的病毒，如流感病毒、HIV等有特別有利的方面。由于這類病毒高度變異的特點，傳統(tǒng)的蛋白疫苗，如重組疫苗、亞單位疫苗或減毒疫苗等僅能對同株或有限的幾株病毒起保護作用，且很少有交叉保護作用?；蛞呙绲膬?yōu)勢在于可利用病毒基因中保守蛋白的序列來誘生針對這些蛋白中的抗原表位(如流感病毒NP)的強大的免疫應答(如CTL)，從而在多種不同病毒株或亞株間誘生有效的交叉保護免疫。第59頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)以抗原表位為基礎的基因免疫抗原表位是抗原分子中被免疫細胞識別、與免疫細胞表面抗原受體結合、誘生特異性免疫應答的最基本的結構和功能單位。1.抗原表位為基礎的基因免疫的優(yōu)點；2.單抗原表位的基因免疫；3.復合抗原表位的基因免疫；4.以免疫球蛋白基因為載體的表位基因免疫。第60頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1.抗原表位為基礎的基因免疫的優(yōu)點①可以用不同功能的T、B細胞抗原表位組成復合免疫分子，從而有目的地誘生各類不同的免疫應答；②避免了天然蛋白中抑制性抗原表位或抑制性成分引起的免疫抑制現(xiàn)象；③通過抗原表位為基礎的基因免疫，可避開易發(fā)生變異的表位。第61頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.單抗原表位的基因免疫用單一抗原表位基因構建重組載體，來進行DNA免疫。GeneencodingtheEpitope(P53:128~145)

ExpresstheEpitope

128129130131132133134135136137138139140141142143144145CTL第62頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月在單抗原表位前，通常在抗原表位序列前加上一些引導序列，如腺病毒E3引導序列與表位序列融合。引導外源多肽進入內質網(wǎng)加工第63頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月Ciemik等p53蛋白的CTL表位(128~145)+E3引導序列HIVgp160中的CTL表位(P18ⅢB)+E3引導序列誘生出保護性CTL應答:與E3引導序列融合表達的表位，基因誘生免疫應答的作用大大強于單用抗原表位的基因免疫。以抗原表位為基礎的細胞內靶向性基因免疫可增強誘生特異性免疫應答的精確性。第64頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.復合抗原表位的基因免疫多種抗原表位基因同時克隆在一個載體里面，來進行DNA免疫——研究最多的方式。Thomoson等將流感病毒、鼠巨細胞病毒、腺病毒、瘧原蟲等共10個CTL表位串聯(lián)表達于真核細胞表達質粒DNA中。第65頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月GenesencodingtheEpitopes[NP(147~155),PP89(168~176),LCMV(118~126)……]

ExpresstheEpitopesCTL第66頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月COOH123456789101112131415161718NH319202122232425262728294.以免疫球蛋白基因為載體的表位基因免疫B細胞表位是天然的，*位于分子的表面或轉折處*為構象依賴性表位*是抗原分子的三級結構T細胞表位是抗原提呈細胞加工提呈的抗原肽，呈線性排列第67頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫球蛋白分子的互補決定區(qū)CDR具有——外顯性(總是暴露在外，隨時準備與相應抗原決定簇結合)；——空間限構(限定的空間構型——即其空間構型不會因為編碼蛋白的后續(xù)修飾如糖基化而改變)。第68頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月外源B細胞抗原表位→直接克隆表達于CDR中→利用CDR限定的空間構型，保證表位的構型正確及免疫原性的穩(wěn)定，并利用CDR結構外顯的特性，使表位的可接近性(accessibility)好，提高表位被吞噬及呈遞的效率。以免疫球蛋白基因為載體的表位基因免疫第69頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月以免疫球蛋白基因為載體的表位基因免疫CDRBcellEpitopeVectorcontainingIggeneGeneencodingIgFabCDR1234567891011121314151617567891011121314151617BcellEpitopeCDRBcellEpitopeBcellBCR12345678910111213141516175678910111213141516171234567891011121314151617病原菌第70頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)表達文庫基因免疫expressionlibraryimmunization,ELIELI技術允許免疫系統(tǒng)自我選擇。ELI技術基本指導思想是將目的抗原的編碼基因隨機克隆于載體。將含有成千上萬個DNA片段的質粒DNA直接免疫動物，再以相應的病原體感染這些動物，觀察是否有保護作用。如有，則可將這成千上萬種混合的質粒DNA分組，再免疫，作保護性感染實驗。有保護后再分組直至選出單一保護性DNA片段。第71頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月病原體一個基因具有所有基因的文庫常規(guī)基因免疫ELI病原體第72頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月具有所有基因的文庫YESNO第73頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月YESNO第74頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月YESNONONO第75頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月ELI特殊應用價值②可從有效的表達文庫中分離出有保護作用的組分，制備成特異性基因疫苗或重組蛋白疫苗。①對于某些抗原成分不明確的病原體，傳統(tǒng)的蛋白免疫或基因免疫的應用受到限制，可利用ELI使機體的免疫系統(tǒng)自行篩選有效的抗原基因產(chǎn)物；工作量非常大，但價值也大。第76頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月六、基因免疫的免疫途徑和方法1.肌肉免疫(一)免疫途徑2.皮內免疫3.脾臟免疫4.其他胃腸外免疫第77頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1.肌肉免疫已知肌細胞攝取外源裸DNA和表達轉基因產(chǎn)物的效率和持久性是其他組織細胞的100~1000倍。Wolff等以PCR和Southern雜交證實質粒DNA可在骨骼肌中存在達1年以上。已在多種動物體內證實肌內基因免疫是誘生特異性體液和細胞免疫的有效途徑。股肌、腓腸肌和脛前肌是肌內免疫中較多采用的肌肉。作為外源DNA和外源蛋白的儲存庫，可少量而長期釋放外源蛋白

第78頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月肌細胞參與基因免疫誘生免疫應答的可能機制▽肌細胞不是傳統(tǒng)意義上的APC，只表達MHCI類分子，不表達MHCII類分子，且不表達B7等共同刺激分子。▽肌細胞攝取局部注射的質粒DNA后被激活，激活的肌細胞表達轉基因產(chǎn)物，這些內源性合成的蛋白抗原，可由MHCI類分子直接呈遞于肌細胞表面。▽在注射局部存在的免疫細胞如樹突細胞、巨噬細胞等APC細胞，通過APC細胞提供其表面的同刺激分子，與呈遞抗原的肌細胞共同激活T、B細胞，誘生免疫應答。▽另一方面，激活的肌細胞壽命短暫，很快凋亡，釋放出細胞內的轉基因產(chǎn)物，為APC攝??；或者含外源基因產(chǎn)物的凋亡肌細胞整個為APC吞噬，經(jīng)加工，MHCII類分子呈遞，誘生體液和細胞免疫應答。第79頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.皮內免疫采用基因槍將金顆粒包裹的DNA注射至表皮內。皮膚作為基因免疫的靶組織具有一定的優(yōu)勢：▽皮膚組織里具有一些專職的APC，如LG細胞、樹突細胞和巨噬細胞等。▽直接攝取基因疫苗，并讓靶基因在細胞內表達，并提呈抗原肽給免疫細胞。第80頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.脾臟免疫是以免疫球蛋白基因為載體的基因免疫采用的一種特殊的免疫方式。脾臟有較多的B細胞(尤其是生發(fā)中心)；將表達外源抗原基因的免疫球蛋白H鏈基因表達質粒DNA直接注射到小鼠的脾臟中，即直接靶向至B細胞，表達含外源抗原的免疫球蛋白——“抗原化抗體”。B細胞同時擔負了外源基因的攝取、抗原的表達、經(jīng)MHCI類或II類分子共同呈遞三重功能。第81頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.其他胃腸外免疫靜脈、皮下、腹腔、粘膜免疫。第82頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)免疫方法3.基因槍免疫1.裸DNA免疫2.脂質體包裹DNA直接注射4.繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法第83頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1.裸DNA免疫以生理鹽水溶解質粒DNA，直接注入體內。▽肌內或皮內注射；▽靜脈注射：肺、脾外源基因表達率最高；▽腹腔內注射：可轉染脾臟中T淋巴細胞及骨髓來源的造血干細胞；▽氣溶膠吸入方式或滴鼻方式：粘膜處產(chǎn)生高滴度SIgA抗體，血清中也可檢出特異性IgG。第84頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.脂質體包裹DNA直接注射陽離子脂質體：由帶陽離子的類脂GAP、DOSPA、DOTAP等磷酰脂膽堿，再加上中性類脂DOPE組成。①陽離子脂質體通過中和DNA表面的負電荷，有利于DNA分子接近靶細胞；②脂質體可與細胞表面的磷脂分子層融合，介導DNA分子進入細胞內；第85頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月③DNA-脂質復合體表面所帶的正電荷使之避免與溶酶體結合而被核酸酶降解；④脂質體還具有幫助DNA進入淋巴系統(tǒng)，定居于區(qū)域淋巴結；⑥中性類脂則起著增強脂質體穩(wěn)定性、降低毒性、提高轉染的作用。⑤脂質體本身是一種免疫佐劑；1g質粒DNA與8nmol的脂質體混合可以最大限度地表達外源蛋白。第86頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.基因槍免疫質粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入表皮內?；驑屪⑸涞膬?yōu)勢：給予極少量的DNA(~10ng)，就足以誘生與10~100g裸DNA肌肉免疫效果相當?shù)拿庖邞?。?7頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月肌肉注射:IgG(IgG2a)、IFN-a(+++)及CTL活性(+++)，IL-4(-)——Th1細胞激活為主；

基因槍注射:IgG(IgG1)、IFN-a(+++)及CTL活性(+++)，IL-4(++)——Th1、Th2細胞混合型激活方式。

效果最好??！第88頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月基因槍免疫的缺點：

3.基因槍價格昂貴：BIORAD公司；1.基因槍接種所誘導的免疫應答持續(xù)時間較短；2.隨環(huán)境溫度上升，金顆粒上包被的DNA會脫落，從而影響免疫效果；4.包被DNA金顆粒制備繁瑣。第89頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法選擇一種容易進入某組織器官的細菌，將其繁殖基因去掉，然后用質粒DNA轉化細菌，當這些細菌進入某組織器官后，由于不能繁殖，則自身裂解而釋放出質粒DNA。缺陷型減毒沙門氏菌、李斯特菌、BCG將DNA疫苗靶向帶入巨噬細胞。第90頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒DNA從吞噬體內→胞漿內：

1.DNA主動逸出而進入胞漿；2.細菌改變吞噬體隔室結構→DNA進入胞漿；李斯特菌產(chǎn)生的李斯特溶素，就可在吞噬體膜上打孔，有利于DNA跑到胞漿中來，以啟動目的蛋白抗原的表達。第91頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法：細胞靶向性：----巨噬細胞。效率低：----吞噬體與吞噬溶酶體融合后，大部分DNA還是會被消化掉的，損失較大。

第92頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)接種劑量與周期

1.接種劑量

小鼠：50~100ug/次。2.接種周期

最佳免疫接種次數(shù)為3次，最佳間隔接種時間為3周。

第93頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月七、免疫保護效果的評價(一)細胞免疫的評價(二)體液免疫的評價第94頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)細胞免疫的評價細胞免疫(cell-mediatedimmunity,CMI)主要針對胞內寄生菌、寄生蟲、病毒、移植物等。▽CD4+Th1細胞活化產(chǎn)生細胞因子起作用；▽CD8+CTL特異性殺傷靶細胞。第95頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1.淋巴細胞增殖功能檢測淋巴細胞增殖實驗又稱為淋巴細胞轉化實驗，T、B淋巴細胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在體外經(jīng)特異性抗原或非特異性有絲分裂原刺激，會產(chǎn)生一系列增殖的變化，如細胞變大、細胞漿豐富、空泡出現(xiàn)、核仁明顯、染色質疏松，淋巴細胞轉變成淋巴母細胞。PHA----非特異淋轉；特異性抗原----僅使已經(jīng)相應抗原致敏的T細胞發(fā)生轉化，通過兩者比較，就可以了解核酸疫苗接種后，淋巴細胞被激活的情況。形態(tài)計數(shù)法、3H-TdR(3H胸腺嘧啶苷)摻入法、MTT(四甲基偶氮唑藍)法。第96頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.T細胞介導的細胞毒作用DNA疫苗活化(或致敏)的CTL再次遇到帶有特異抗原的靶細胞時，可表現(xiàn)出對靶細胞的破壞和溶解作用。該作用是受MHCI類分子限制的，即CTL識別的抗原要靠與MHCI類分子結合，同時必須是自已本身的MHCI類分子。機體內大多數(shù)有核細胞都有MHCI分子，都有可能成為本身CTL的靶細胞。從經(jīng)相應DNA疫苗免疫的小鼠脾臟分離單核細胞作為效應細胞(CTL)，選擇來源于同一品系(遺傳背景相同)、帶有特異抗原的腫瘤細胞系作為靶細胞，來進行細胞毒實驗。方法：51Cr釋放試驗、乳酸脫氫酶釋放試驗等。第97頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.細胞因子檢測Th1型細胞因子：IL-2、IL-12、IFN-r等，促進細胞免疫；Th2型細胞因子：IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，促進體液免疫等。▽免疫學方法，如ELISA等；▽生物學方法，即細胞因子活性檢測；▽分子生物學方法，如分子雜交、RT-PCR等。第98頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.特異性致敏淋巴細胞檢測酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)

第99頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月ELISPOT第100頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)體液免疫的評價核酸疫苗誘導抗原特異性B細胞分化為漿細胞，產(chǎn)生特異性抗體，抗體再發(fā)揮中和抗原等生物學效應。通過抗體的檢測來評價DNA疫苗誘導的體液免疫水平。用已知抗原測特異性抗體：如雙向瓊脂擴散試驗、ELISA法、免疫熒光法、放射免疫法、Westernblot等。第101頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月八、核酸疫苗的安全性評價質粒