糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵抑制的耐受性探究畢業(yè)論文

合肥師范學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）引言裝訂線裝訂線1.1本課題的目的及意義L-蘋(píng)果酸在蔬菜和蘋(píng)果中普遍存在，是一種極其重要的有機(jī)酸[1]；其口感與天然蘋(píng)果的酸味相接近，是一種優(yōu)良的酸味劑和保鮮劑；它具有味道柔和，酸度大，滯留時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)[2]。目前，在高檔飲料與食品行業(yè)，L-蘋(píng)果酸已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其也用于治療肝功能不全、肝衰竭和貧血等疾病，已經(jīng)在醫(yī)藥上有著重要的作用。近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)于L-蘋(píng)果酸的需求量越來(lái)越大[3]。小麥麩皮是面粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)品，其主要用途是作為飼料和發(fā)酵。小麥麩皮中含有大量纖維類(lèi)物質(zhì)，作為飼料的話，難以被動(dòng)物吸收，從而造成資源浪費(fèi)。我國(guó)每年生產(chǎn)的小麥麩皮約有2000萬(wàn)噸，若這些小麥麩皮中的纖維物質(zhì)能夠得到有效利用，則小麥麩皮的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效應(yīng)將會(huì)得到很大提升。有文獻(xiàn)指出可以對(duì)小麥麩皮進(jìn)行烯酸處理，在高溫條件下酸解小麥麩皮纖維，可產(chǎn)生木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等單糖，且糖含量以及糖化率較理想[4]，酸解小麥麩皮所產(chǎn)生的單糖可作為發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的原料。小麥麩皮作為一種可再生資源既得到合理利用，又增加了蘋(píng)果酸的生產(chǎn)途徑，降低了蘋(píng)果酸的生產(chǎn)成本。在酸解小麥麩皮的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生糠醛、5-羥甲基糠醛等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)后期菌種發(fā)酵利用糖化液有影響；本文對(duì)小麥麩皮酸解過(guò)程中糠醛、5-羥甲基糠醛等物質(zhì)含量的多少進(jìn)行測(cè)定，并且利用曲霉發(fā)酵制備蘋(píng)果酸的特性，在發(fā)酵過(guò)程中分別添加糠醛、5-羥甲基糠醛等物質(zhì)，研究這些物質(zhì)對(duì)曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸的影響及適應(yīng)濃度等。通過(guò)糠醛、5-羥甲基糠醛等物質(zhì)對(duì)曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸的影響研究，得到這些物質(zhì)在蘋(píng)果酸發(fā)酵過(guò)程中影響的條件以及適應(yīng)濃度，對(duì)于日后利用小麥麩皮酸解后發(fā)酵有著重要的指導(dǎo)意義。根據(jù)研究所得的結(jié)果可以對(duì)發(fā)酵制備蘋(píng)果酸的條件進(jìn)行改善，可以提高曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸產(chǎn)酸率，使得蘋(píng)果酸生產(chǎn)量得到提升。這樣即提升了小麥麩皮的利用率，又降低了生產(chǎn)蘋(píng)果酸的成本。1.2國(guó)內(nèi)外發(fā)展?fàn)顩rL-蘋(píng)果酸普遍存在于植物、動(dòng)物及微生物細(xì)胞中，是生物體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的重要有機(jī)酸。L-蘋(píng)果酸最早期的生產(chǎn)方法是提取法，是從生物代謝過(guò)程中提取出的。這種方法產(chǎn)量極低，后來(lái)發(fā)展有化學(xué)合成法，發(fā)酵法，酶催化法等多種方法[2]。在上個(gè)世紀(jì)初，人們研究發(fā)現(xiàn)某些霉菌和酵母可產(chǎn)生L-蘋(píng)果酸。此后，人們嘗試?yán)梦⑸锓ㄖ苯由a(chǎn)制取L-蘋(píng)果酸，但由于成本高，生產(chǎn)規(guī)模小，未能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化[5]。1959年，日本的Kitahara等利用短乳桿菌產(chǎn)生的富馬酸酶催化化合制取富馬酸轉(zhuǎn)化成了L-蘋(píng)果酸，使得蘋(píng)果酸的研究進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)期[6,7]。之后在此方面，日本進(jìn)行了大量的研究，并領(lǐng)先于世界水平，他們將生產(chǎn)的L-蘋(píng)果酸主要用于醫(yī)藥行業(yè)[5]?，F(xiàn)在，天然糖質(zhì)被世界上許多國(guó)家作為原料，采用霉菌單一菌種發(fā)酵，霉菌加酵母或者細(xì)菌混種發(fā)酵用來(lái)生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸，但產(chǎn)量不高。目前，工業(yè)上是先以苯為原料生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸，在通過(guò)化學(xué)催化法制備富馬酸，在酶的催化生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸[8,9]。但是人們對(duì)食品安全越來(lái)越關(guān)注，以及對(duì)自身的健康意識(shí)越來(lái)越強(qiáng)，人們將目光逐漸轉(zhuǎn)入到可在生物資為原料的全生物法發(fā)酵制備L-蘋(píng)果酸。其中，制備L-蘋(píng)果酸的微生物法有兩種，即“一步發(fā)酵法”和“兩步發(fā)酵法”[2]。小麥麩皮作為面粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，每年有大量的產(chǎn)量，卻不能夠得到有效的利用。有文獻(xiàn)指出可以利用酸解的方法對(duì)小麥進(jìn)行處理，可以使小麥麩皮中的纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化為木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等單糖，而且糖含量以及糖化率較理想[4]。我們可以將這些單糖用于發(fā)酵生產(chǎn)Ｌ-蘋(píng)果酸，這樣就得到一種生產(chǎn)制備L-蘋(píng)果酸的新途徑，并且原料成本低廉，工藝較簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，是一種可行的生產(chǎn)路線。酸解小麥麩皮過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生糠醛、5-羥甲基糠醛等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)后期菌種發(fā)酵蘋(píng)果酸利用糖化液有抑制影響，本文研究的是酸解小麥麩皮過(guò)程中糠醛、5-羥甲基糠醛含量特點(diǎn)，并且利用曲霉發(fā)酵制備蘋(píng)果酸的特性，在發(fā)酵過(guò)程中分別添加糠醛、5-羥甲基糠醛兩種物質(zhì)，研究這些物質(zhì)對(duì)曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸的影響及適應(yīng)濃度等。2材料和方法2.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑實(shí)驗(yàn)材料：小麥麩皮（合肥市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)）；寄生曲霉（CICC40365）實(shí)驗(yàn)試劑：實(shí)驗(yàn)試劑純度生產(chǎn)廠商硫酸分析純（AR）上海博河精細(xì)化學(xué)品有限公司無(wú)水乙醇分析純（AR）上海振企化學(xué)試劑有限公司活性炭（粉末）分析純（AR）天津市永大化學(xué)試劑有限公司5-羥甲基糠醛分析純（AR）上海晶純?cè)噭┯邢薰究啡┓治黾儯ˋR）南開(kāi)市光復(fù)精細(xì)化工研究所L-蘋(píng)果酸分析純（AR）上海晶純?cè)噭┯邢薰?,7-萘二酚分析純（AR）上海晶純?cè)噭┯邢薰酒咸烟欠治黾儯ˋR）天津市博迪化工股份有限公司硫酸銨分析純（AR）上海試劑四廠KH2PO4分析純（AR）西隴化工股份有限公司K2HPO4分析純（AR）西隴化工股份有限公司MgSO4·7H2O分析純（AR）天津市博迪化工股份有限公司CaCl2·2H2O分析純（AR）淮南市化學(xué)試劑廠FeSO4·7H2O分析純（AR）西隴化工股份有限公司MnSO4分析純（AR）上海上浦化工有限公司2.2實(shí)驗(yàn)用具與設(shè)備實(shí)驗(yàn)用具：500mL燒杯，250mL錐形瓶，100mL容量瓶，培養(yǎng)皿，研缽，滴定管，移液槍實(shí)驗(yàn)設(shè)備：實(shí)驗(yàn)設(shè)備型號(hào)生產(chǎn)廠商電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082BS-Ⅲ上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司恒溫水浴鍋HH-1金壇市杰瑞爾電器有限公司低速離心機(jī)TDL-5-A上海楚柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司可見(jiàn)分光光度計(jì)722S上海精密科學(xué)儀器有限公司紫外分光光度計(jì)UV762上海精密科學(xué)儀器有限公司氣浴恒穩(wěn)振蕩器THZ-82B江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50FB上海申安醫(yī)療器械廠電子分析天平FA1604上海衡平儀器廠2.3實(shí)驗(yàn)方法 2.3.1糠醛、5-羥甲基糠醛與蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與測(cè)定方法糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取1g糠醛標(biāo)準(zhǔn)品，用95%乙醇定容于100mL容量瓶中，得到1%糠醛標(biāo)準(zhǔn)貯備液。用時(shí)將糠醛標(biāo)準(zhǔn)貯備液用50%乙醇準(zhǔn)確稀釋至100.00mg/L，分別配制濃度為1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg/L的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，以50%乙醇為空白，分光光度法測(cè)定OD276處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程[10]。經(jīng)測(cè)量不同濃度梯度的糠醛相對(duì)應(yīng)的OD值如圖2-1圖2-1糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線從該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，糠醛濃度在0.10～10.00mg/L之間對(duì)應(yīng)的吸光度基本呈線性相關(guān)，得到糠醛標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=01899x-0.0163；R=0.9966，式中：y為吸光度：x為糠醛的濃度。樣品測(cè)定方法：吸取樣品1mg/L樣品，用50%乙醇溶液稀釋?zhuān)ㄏ♂尯罂啡┖吭?.00~10.00mg/L之間）,混勻，分光光度法測(cè)定OD276處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程計(jì)算出樣品中糠醛含量。5-羥甲基糠醛與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取5mg的5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容于100mL容量瓶中,得到濃度為50.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液,將50.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋,分別配制濃度為1.00、3.00、6.00、9.00、12.00、15.00、18.00、21.00mg/L的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蒸餾水為調(diào)零液，分光光度法測(cè)定OD284處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程[11]。經(jīng)測(cè)量不同濃度梯度的5-羥甲基糠醛糠醛相對(duì)應(yīng)的OD值如圖2-2圖2-25-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線從該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，5-羥甲基糠醛濃度在1.00～18.00mg/L之間對(duì)應(yīng)的吸光度基本呈線性相關(guān)，則得到5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.1236x+0.0249；R=0.9969，式中：y為吸光度，x為5-羥甲基糠醛濃度。樣品測(cè)定方法：吸取樣品1mg/L樣品，用蒸餾水稀釋?zhuān)ㄏ♂尯?-羥甲基糠醛含量在1.00~21.00mg/L之間）,分光光度法測(cè)定OD284處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程計(jì)算出樣品中5-羥甲基糠醛糠醛含量。蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與測(cè)定方法蘋(píng)果酸的檢測(cè)利用的是Goodban法[12]。2,7–萘二酚溶液：取1g2,7–萘二酚溶解在100mL98%濃硫酸中。此溶液可在4℃下保存數(shù)月[13]。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10.0mg，用蒸餾水定容于100mL容量瓶，所得到濃度為100.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。將100.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液稀釋?zhuān)謩e配制濃度為10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00mg/L的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別移入到已編號(hào)的試管中各1mL，眼試管壁緩慢加入6.00mL濃硫酸，并加入0.10mL2,7–萘二酚溶液，然后在100℃的沸水中水浴20min，待溶液冷卻到室溫，分光光度法測(cè)定OD390處吸光值，空白對(duì)照采用蒸餾水，按以上方法相同處理。根據(jù)所測(cè)吸光值繪制蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程。經(jīng)測(cè)量不同濃度梯度的蘋(píng)果酸相對(duì)應(yīng)的OD值如圖2-3圖2-3蘋(píng)果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線從該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，蘋(píng)果酸濃度在10.00～80.00mg/L之間對(duì)應(yīng)的吸光度基本呈線性相關(guān)，得到蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=0.0092x+0.0307；R=0.9979，其中y為吸光度，x為蘋(píng)果酸濃度。樣品測(cè)定方法：吸取樣品溶液1.00mL（蘋(píng)果酸濃度控制在5.00～80.00mg/L）于干凈試管中，取6.00mL分析純的濃硫酸，沿管壁緩慢加入，再加入0.1mL2,7-萘二酚試劑，放入100℃水浴鍋中加熱20min，冷卻至室溫后，分光光度法測(cè)定OD390處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出樣品中蘋(píng)果酸含量。2.3.2小麥麩皮酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛含量測(cè)定小麥麩皮粉碎并過(guò)30目篩，在80℃烘干后室溫保存。對(duì)上述處理后的小麥麩皮進(jìn)行酸解，按照下列濃度配置酸解液：硫酸濃度為1.5%，底物即小麥麩皮纖維濃度為67g/L。然后將配置好的酸解液在100℃下，酸解3個(gè)小時(shí)[4]。將酸解后的小麥麩皮溶液在3000r/min下離心10min，取上清液分別稀釋200倍、300倍和400倍，以50%乙醇為調(diào)零液，分光光度法測(cè)定OD276處吸光值，根據(jù)糠醛的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出糠醛含量，并計(jì)算出平均值；再次取上述稀釋后的上清液，以蒸餾水為調(diào)零液，分光光度法測(cè)定OD284處吸光值，根據(jù)5-羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出5-羥甲基糠醛含量，并計(jì)算出平均值。2.3.3小麥麩皮酸解液的脫毒條件優(yōu)化使用活性炭吸附法脫毒，研究活性炭濃度、溫度和時(shí)間對(duì)酸解液中糠醛、5-羥基糠醛脫毒處理效果。脫毒優(yōu)化條件如表2-1表2-1脫毒優(yōu)化條件分組 分組優(yōu)化參數(shù)12345活性炭濃度（%）0.511.52\溫度（℃）30405060\時(shí)間（min）2030405060根據(jù)表2-1的方案對(duì)小麥麩皮酸解液脫毒，并測(cè)出脫毒后酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛的含量，制作出糠醛與5-羥甲基糠醛的活性炭吸附性曲線。做三次平行組，結(jié)果取平均值，并進(jìn)行單因素方差分析[14]。2.3.4探究糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵抑制的耐受性寄生曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸周期的探究本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵所用的菌種為寄生曲霉。培養(yǎng)基配制方法：將土豆切成小塊，取100g土豆放入1L水中在100℃煮沸30min，過(guò)濾出濾液；在濾液中分別加入30g的葡萄糖和18g左右的瓊脂，溶解，滅菌。在超凈工作臺(tái)上，用劃線分離法在培養(yǎng)皿中分離出寄生曲霉，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三天之后取出培養(yǎng)基，在斜面培養(yǎng)基中接種單個(gè)的菌落，得到純種菌落，并制作種子培養(yǎng)液。按照以下配方配制蘋(píng)果酸發(fā)酵液：葡萄糖100g/L、(NH4)2SO42.5g/L、KH2PO40.1g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、CaCl2·2H2O0.1g/L、FeSO4·7H2O0.5g/L、MnSO40.1g/L、NaCl0.005g/L[15]。將配置好的發(fā)酵液分別等量加入到4瓶250mL的錐形瓶中，滅菌后分別在超凈工作臺(tái)上接入2mL的寄生曲霉種子培養(yǎng)液，放入恒溫?fù)u床中200r/min，30℃下培養(yǎng)。然后根據(jù)蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線每隔24小時(shí)測(cè)得培養(yǎng)液中蘋(píng)果酸的含量，做出蘋(píng)果酸發(fā)酵產(chǎn)量的周期曲線，確定寄生曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸的周期。糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響利用單因素法探究糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響，在相同的發(fā)酵液中分別添加等梯度濃度的糠醛或5-羥甲基糠醛，在恒溫?fù)u床中以200r/min，30℃條件下發(fā)酵相同時(shí)間。在發(fā)酵培養(yǎng)液中分別添加的糠醛或5-羥甲基糠醛含量，如表2-2表2-2糠醛、5-羥甲基糠醛添加量分組 添加物12345糠醛（mg/L）1003005007009005-羥甲基糠醛（mg/L）100300500700900以上發(fā)酵液中除添加物以外，其發(fā)酵液成分，體積，接種量，發(fā)酵條件等條件均為一致，除此之外，每組發(fā)酵液都有空白對(duì)照組。發(fā)酵周期后，測(cè)出含有不同添加物發(fā)酵液中蘋(píng)果酸的含量。2.3.5小麥麩皮酸解液脫毒后對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響分別以葡萄糖，小麥麩皮酸解液，以及脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源，配制相同發(fā)酵液（各發(fā)酵液中糖含量保持相同），在200r/min，30℃，發(fā)酵5天。觀察不同碳源發(fā)酵蘋(píng)果酸的產(chǎn)酸量。3結(jié)果與分析裝訂線裝訂線3.1小麥麩皮酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛含量測(cè)定經(jīng)計(jì)算得到,小麥麩皮酸解液中糠醛的濃度為481.11mg/L，5-羥甲基糠醛的濃度為573.37mg/L。具體結(jié)果如表3-1所示表3-1糠醛5-羥甲基糠醛含量OD值濃度(mg/L)稀釋倍數(shù)樣品濃度(mg/L）平均值（mg/L）糠醛0.44352.4212200482.25481.110.28021.5629300468.400.21761.2317400492.685-羥甲基糠醛0.37182.8066200561.32565.280.26141.9134300574.020.19811.4012400560.513.2小麥麩皮酸解液的脫毒條件優(yōu)化3.2.1活性炭用量對(duì)酸解液脫毒效果的影響向小麥麩皮酸解液中分別添加粉末狀的活性炭0.5%，1.0%，1.5%，2.0%。在60℃下攪拌30min，觀察其對(duì)小麥麩皮酸解液的脫毒能力，見(jiàn)圖3-1圖3-1活性炭用量對(duì)酸解液脫毒效果的影響由圖3-1可知，隨著活性炭濃度的增加，酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛含量在逐漸減小，所以活性炭對(duì)5-羥甲基糠醛與糠醛有一定的吸附能力，但當(dāng)活性炭含量超過(guò)1%時(shí)，表中糠醛的曲線下降趨勢(shì)緩慢，5-羥甲基糠醛的曲線無(wú)明顯下降趨勢(shì)；經(jīng)方差分析得出活性炭的用量對(duì)糠醛與5-羥甲基糠醛脫除有極顯著影響（P<0.01）。通過(guò)糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵影響發(fā)現(xiàn)當(dāng)糠醛濃度大于100mg/L時(shí)，對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵抑制作用增加不太明顯；且有文獻(xiàn)指出，隨著活性炭含量的增大，對(duì)酸解液中糖含量有一定影響[14]。因此，選用活性炭含量為1%，此時(shí)糠醛脫去率為71.09%，5-羥甲基糠醛脫去率為77.48%。3.2.2時(shí)間對(duì)酸解液脫毒效果的影響向小麥麩皮酸解液中添加活性炭含量均為1%，分別在60℃下攪拌20min，30min，40min，50min，60min，觀察其對(duì)小麥麩皮酸解液的脫毒能力[14]，見(jiàn)圖3-2圖3-2時(shí)間對(duì)酸解液脫毒效果的影響通過(guò)圖3-2可看出，20～30min的過(guò)程中吸附性曲線有明顯下降，但在30～60min無(wú)下降趨勢(shì)；經(jīng)方差分析得出時(shí)間對(duì)糠醛與5-羥甲基糠醛脫除有極顯著影響（P<0.01）。30min后糠醛與5-羥甲基糠醛濃度上升原因可能是：活性炭的吸附為物理反應(yīng)，過(guò)程是放熱的，當(dāng)吸附平衡時(shí)，溫度過(guò)高破壞了吸附質(zhì)和吸附劑間的范德華力，致使吸附量減少，所吸附的糠醛與5-羥甲基糠醛被解吸，導(dǎo)致吸附量下降[16]。因此，脫毒時(shí)間選用30min，此時(shí)糠醛脫去率為75.82%，5-羥甲基糠醛脫去率為80.08%。3.2.3溫度對(duì)酸解液脫毒效果的影響向小麥麩皮酸解液中添加活性炭含量均為1%，分別在30℃，40℃，50℃，60℃下攪拌30min，觀察其對(duì)小麥麩皮酸解液的脫毒能力[14]，見(jiàn)圖3-3圖3-3溫度對(duì)酸解液脫毒效果的影響由圖3-3可以看出，當(dāng)溫度在20℃～30℃時(shí)，吸附性曲線呈下降趨勢(shì)；30℃～50℃時(shí)，吸附性曲線呈上升趨勢(shì)；而50℃～60℃時(shí)，呈下降趨勢(shì)；經(jīng)方差分析，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)小麥麩皮酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛的脫去有顯著影響（P<0.05）。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，吸附性曲線處于最低點(diǎn)，因此，可以確定脫毒溫度應(yīng)選擇30℃，此時(shí)，糠醛脫去率為75.82%，5-羥甲基糠醛脫去率為77.31%綜上所述，小麥麩皮酸解液的脫毒條件為活性炭含量1.0%、溫度30℃、時(shí)間30min。3.3探究糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵抑制的耐受性3.3.1寄生曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸周期的探究以寄生曲霉為發(fā)酵菌種，在恒溫?fù)u床中以200r/min，30℃下發(fā)酵，每隔24小時(shí)測(cè)得蘋(píng)果酸產(chǎn)生量如圖3-4圖3-4寄生曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸周期由圖3-4可以看出,培養(yǎng)時(shí)間在1～2天時(shí)，寄生曲霉在此期間大量繁殖，蘋(píng)果酸的產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢；培養(yǎng)時(shí)間在2～3天時(shí)，蘋(píng)果酸的產(chǎn)量增長(zhǎng)比較明顯；培養(yǎng)時(shí)間在3～4天時(shí)，寄生曲霉的數(shù)量以及活性都達(dá)到最佳值，蘋(píng)果酸的產(chǎn)量增長(zhǎng)速率達(dá)到最大；培養(yǎng)時(shí)間在4～5天時(shí)，碳源減少，蘋(píng)果酸的增長(zhǎng)速率變緩；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間到第5天時(shí)，L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量不再增長(zhǎng)。因此，寄生曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蘋(píng)果酸的發(fā)酵周期為5天。3.3.2糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響（1）糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響將發(fā)酵培養(yǎng)液分為兩大組，每小組6瓶發(fā)酵液，含量都是50mL，分別加入不同體積的糠醛，使得每組發(fā)酵液中糠醛含量成梯度，分別是0mg/L，100mg/L，300mg/L，500mg/L，700mg/L，900mg/L；每組接入的寄生曲霉種子培養(yǎng)基為2mL，移入恒溫?fù)u床中在200r/min，30℃條件下發(fā)酵5天。發(fā)酵完成后產(chǎn)酸量如圖3-5圖3-5不同濃度糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響經(jīng)方差分析可得出，糠醛含量對(duì)寄生曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸量存在極顯著影響(P<0.01)。由圖3-5可以看出糠醛對(duì)寄生曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蘋(píng)果酸有明顯的抑制作用，隨著發(fā)酵液中糠醛的濃度的增加，產(chǎn)酸量逐漸減小，即發(fā)酵液中糠醛含量越高，蘋(píng)果酸發(fā)酵產(chǎn)酸率就越低，糠醛的抑制作用就越明顯。（2）5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響將發(fā)酵培養(yǎng)液分為6組，每組發(fā)酵液含量是50mL，分別加入不同體積的5-羥甲基糠醛，使得每組發(fā)酵液中5-羥甲基糠醛含量成梯度，分別是0mg/L，100mg/L，300mg/L，500mg/L，700mg/L，900mg/L；每組接入的寄生曲霉種子培養(yǎng)基為2ml，移入恒溫?fù)u床中在200r/min，30℃條件下發(fā)酵5天。發(fā)酵完成后產(chǎn)酸量如圖3-6圖3-6不同濃度5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響經(jīng)方差分析可得出，5-羥甲基糠醛含量對(duì)寄生曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸量存在極顯著差異(P<0.01)。由圖3-6可以看出5-羥甲基糠醛對(duì)寄生曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蘋(píng)果酸也有明顯的抑制作用，隨著發(fā)酵液中5-羥甲基糠醛的濃度的增加，產(chǎn)酸量逐漸減小。但在5-羥甲基糠醛濃度高于300mg/L時(shí)，曲線下降趨勢(shì)變得緩慢，即再增加5-羥甲基糠醛含量時(shí)，其抑制作用隨著5-羥甲基糠醛濃度增加而增加的不明顯。綜上所述可知，糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)寄生曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蘋(píng)果酸有明顯的抑制作用。糠醛的含量越高，對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的抑制作用越明顯；而5-羥甲基糠醛濃度在高于300mg/L時(shí)其抑制作用便不隨其濃度的增加而有明顯的提高。3.4小麥麩皮酸解液脫毒前后對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵的影響分別以葡萄糖，小麥麩皮酸解液，以及脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源，發(fā)酵產(chǎn)酸量如圖3-7所示圖3-7不同碳源發(fā)酵的產(chǎn)酸量經(jīng)測(cè)量以葡萄糖、小麥麩皮酸解液以及脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源發(fā)酵蘋(píng)果酸產(chǎn)酸量分別是25.43%、8.32%、15.56%，經(jīng)方差分析得出不同碳源對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵有顯著影響（P<0.05）。從圖3-7可以看出，小麥麩皮酸解液脫毒后發(fā)酵蘋(píng)果酸的產(chǎn)量明顯比未脫毒前高，因此對(duì)小麥麩皮酸解液脫毒可以明顯提高其發(fā)酵產(chǎn)酸量。4討論小麥麩皮酸解過(guò)程產(chǎn)生的糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)蘋(píng)果酸抑制的作用隨其濃度的升高而增加；使用活性炭對(duì)小麥麩皮酸解液進(jìn)行脫毒，經(jīng)探究得出脫毒的最適條件是在活性炭含量1.0%、溫度30℃、時(shí)間30min，在此條件下，小麥麩皮酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛的除去率在70%以上；通過(guò)此條件對(duì)小麥麩皮酸解液進(jìn)行脫毒可以使得酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛含量下降到150mg/L以下，可以使得這兩種抑制物對(duì)酸解小麥麩皮酸解后的發(fā)酵抑制作用降低到最小。如今，蘋(píng)果酸的需求量越來(lái)越大，出現(xiàn)了供不應(yīng)求的局面[5]，小麥麩皮作為一種可再生資源，其作為原料發(fā)酵蘋(píng)果酸是一種經(jīng)濟(jì)、可行的方式。小麥麩皮酸解成糖化液后，須使用活性炭在適合的條件下對(duì)其進(jìn)行脫毒處理，使小麥麩皮酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛的抑制物濃度降低，以減小它們對(duì)酸解小麥麩皮發(fā)酵產(chǎn)生蘋(píng)果酸的抑制作用，提高蘋(píng)果酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率。

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