高效液相色譜法操作規(guī)程

PAGEPAGE1高效液相色譜法操作規(guī)程第一篇：高效液相色譜法操作規(guī)程高效液相色譜法操作規(guī)程1．目的：規(guī)范高效液相色譜法檢驗(yàn)操作。2．范圍：適用于本公司中藥材用高效液相法的檢驗(yàn)。3．責(zé)任：檢驗(yàn)室主任和相關(guān)檢驗(yàn)員對(duì)本操作規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。4．內(nèi)容：4.1標(biāo)準(zhǔn)名稱高效液相色譜法{中華人民共和國(guó)藥典（20XX年版一部）附錄VID}。4.2對(duì)儀器的一般要求所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑，用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑，用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。在用紫外吸收檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求。正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20XX內(nèi)記錄完畢。4.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。4.3.1色譜柱的理論板數(shù)（n）在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同，但應(yīng)取相同單位）和半峰高寬（Wh/2），按n=5.54（tR/Wh/2）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長(zhǎng)、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。4.3.2分離度定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計(jì)算公式為：R=2(tR2tR1)W1W2式中：tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。4.3.3重復(fù)性取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120XX對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。4.4.4拖尾因子為保證測(cè)量精度，特別當(dāng)采用峰高法測(cè)量時(shí)，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子（T）是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為：T=W0.05h2d1式中：W0.05h為0.05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95—1.05之間。4.4測(cè)定法定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，須采用峰面積法。4.4.1內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：校正因子（f）=AS/CSAR/CR式中：AS——為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；AR——為對(duì)照品的峰面積或峰高；CS——為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；CR——為對(duì)照品的濃度。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：含量（CX）=f·AXAS/CS式中：AX為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；CX為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度。f、AS和CS的意義同上。當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。4.4.2外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和供試品待測(cè)成分的峰面積（峰高），按下式計(jì)算含量：AXAR式中各符號(hào)意義同上。含量（CX）=CR4.4.3加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)成分對(duì)照品各適量，配制測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種正文中，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)儀器靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過(guò)載為限），使對(duì)照溶液的主成分色譜峰高約達(dá)滿量程的10%—25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分（面積約為通常條件下滿量程峰積分值的10%），然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的若干倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。4.4.4不加校正因子的主成分自身對(duì)照法當(dāng)沒有雜質(zhì)對(duì)照品時(shí)，可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。同上述（3）法配制對(duì)照溶液并調(diào)節(jié)儀器靈敏度后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的若干倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計(jì)算。4.4.5面積歸一化法由于峰面積歸一化法測(cè)定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。方法是測(cè)量各雜質(zhì)峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率，即得。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí)，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。第二篇：PMP柱前衍生高效液相色譜法的機(jī)理PMP柱前衍生高效液相色譜法的機(jī)理，以PMP與葡萄糖的反應(yīng)為例：經(jīng)PMP衍生化的單糖，在250nm有強(qiáng)烈的吸收，且衍生化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易分解，分析時(shí)其他雜質(zhì)干擾小。第三篇：氣相及液相色譜法基礎(chǔ)知識(shí)氣相色譜法基礎(chǔ)知識(shí)一、氣相色譜的簡(jiǎn)要介紹氣相色譜法是二十世紀(jì)五十年代出現(xiàn)的一項(xiàng)重大科學(xué)技術(shù)成就。這是一種新的分離、分析技術(shù)，它在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、國(guó)防、建設(shè)、科學(xué)研究中都得到了廣泛應(yīng)用。氣相色譜可分為氣固色譜和氣液色譜。氣固色譜的“氣”字指流動(dòng)相是氣體，“固”字指固定相是固體物質(zhì)。例如活性炭、硅膠等。氣液色譜的“氣”字指流動(dòng)相是氣體，“液”字指固定相是液體。例如在惰性材料硅藻土涂上一層角鯊?fù)?，可以分離、測(cè)定純乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烯、丙烷等雜質(zhì)。二、氣相色譜法的特點(diǎn)氣相色譜法是指用氣體作為流動(dòng)相的色譜法。由于樣品在氣相中傳遞速度快，因此樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間可以瞬間地達(dá)到平衡。另外加上可選作固定相的物質(zhì)很多，因此氣相色譜法是一個(gè)分析速度快和分離效率高的分離分析方法。近年來(lái)采用高靈敏選擇性檢測(cè)器，使得它又具有分析靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。三、氣相色譜法的應(yīng)用在石油化學(xué)工業(yè)中大部分的原料和產(chǎn)品都可采用氣相色譜法來(lái)分析；在電力部門中可用來(lái)檢查變壓器的潛伏性故障；在環(huán)境保護(hù)工作中可用來(lái)監(jiān)測(cè)城市大氣和水的質(zhì)量；在農(nóng)業(yè)上可用來(lái)監(jiān)測(cè)農(nóng)作物中殘留的農(nóng)藥；在商業(yè)部門可和來(lái)檢驗(yàn)及鑒定食品質(zhì)量的好壞；在醫(yī)學(xué)上可用來(lái)研究人體新陳代謝、生理機(jī)能；在臨床上用于鑒別藥物中毒或疾病類型；在宇宙舴中可用來(lái)自動(dòng)監(jiān)測(cè)飛船密封倉(cāng)內(nèi)的氣體等等。氣相色譜專業(yè)知識(shí)氣相色譜氣相色譜是一種以氣體為流動(dòng)相的柱色譜法，根據(jù)所用固定相狀態(tài)的不同可分為氣-固色譜(GSC)和氣-液色譜(GLC)。氣相色譜原理氣相色譜的流動(dòng)相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。當(dāng)多組分的混合樣品進(jìn)入色譜柱后，由于吸附劑對(duì)每個(gè)組分的吸附力不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度也就不同。吸附力弱的組分容易被解吸下來(lái)，最先離開色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，而吸附力最強(qiáng)的組分最不容易被解吸下來(lái)，因此最后離開色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進(jìn)入檢測(cè)器中被檢測(cè)、記錄下來(lái)。氣相色譜流程載氣由高壓鋼瓶中流出，經(jīng)減壓閥降壓到所需壓力后，通過(guò)凈化干燥管使載氣凈化，再經(jīng)穩(wěn)壓閥和轉(zhuǎn)子流量計(jì)后，以穩(wěn)定的壓力、恒定的速度流經(jīng)氣化室與氣化的樣品混合，將樣品氣體帶入色譜柱中進(jìn)行分離。分離后的各組分隨著載氣先后流入檢測(cè)器，然后載氣放空。檢測(cè)器將物質(zhì)的濃度或質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ碾娦盘?hào)，經(jīng)放大后在記錄儀上記錄下來(lái)，就得到色譜流出曲線。根據(jù)色譜流出曲線上得到的每個(gè)峰的保留時(shí)間，可以進(jìn)行定性分析，根據(jù)峰面積或峰高的大小，可以進(jìn)行定量分析。氣相色譜儀由以下五大系統(tǒng)組成：氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測(cè)記錄系統(tǒng)。組分能否分開，關(guān)鍵在于色譜柱；分離后組分能否鑒定出來(lái)則在于檢測(cè)器，所以分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)是儀器的核心。氣相色譜儀液相色譜法液相色譜法氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)果，而必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照定性。當(dāng)無(wú)純物質(zhì)對(duì)照時(shí)，定性鑒定就很困難，這時(shí)需借助質(zhì)譜、紅外和化學(xué)法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點(diǎn)可高效液相色譜法來(lái)克服。液相色譜法就是用液體作為流動(dòng)相的色譜法。1903年俄國(guó)化學(xué)家M.C.茨維特首先將液相色譜法用于分離葉綠素。原理和分類液相色譜法的分離機(jī)理是基于混合物中各組分對(duì)兩相親和力的差別。根據(jù)固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜。應(yīng)用最廣的是以硅膠為填料的液固色譜和以微硅膠為基質(zhì)的鍵合相色譜。根據(jù)固定相的形式，液相色譜法可以分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。近年來(lái)，在液相柱色譜系統(tǒng)中加上高壓液流系統(tǒng)，使流動(dòng)相在高壓下快速流動(dòng)，以提高分離效果，因此出現(xiàn)了高效（又稱高壓）液相色譜法。①液固吸附色譜。高效液相色譜中的一種，是基于物質(zhì)吸附作用的不同而實(shí)現(xiàn)分離。其固定相是一些具有吸附活性的物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。②液液分配色譜法。基于被測(cè)物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度的差異，通過(guò)溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配以實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)固定相與流動(dòng)相的極性不同，分為正相色譜和反相色譜。前者是用硅膠或極性鍵合相為固定相，非極性溶劑為流動(dòng)相；后者是硅膠為基質(zhì)的烷基鍵合相為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相，適用于非極性化合物的分離。③離子交換色譜法?；陔x子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子對(duì)離子交換基具有不同的親和力而實(shí)現(xiàn)分離。薄殼型離子交換樹脂柱效高，主要用來(lái)分離簡(jiǎn)單的混合物；多孔性樹脂進(jìn)樣容量大，主要用來(lái)分離復(fù)雜混合物。④凝膠滲透色譜法[1]。又稱為尺寸排阻色譜法。1959年首先用于生物化學(xué)領(lǐng)域。以溶劑為流動(dòng)相，多孔填料（如多孔硅膠、多孔玻璃）或多孔交聯(lián)高分子凝膠為分離介質(zhì)的液相色譜法。當(dāng)混合物溶液入凝膠色譜柱后，流經(jīng)多孔凝膠時(shí)，體積比多孔凝膠孔隙大的分子不能滲透到凝膠孔隙里去而從凝膠顆粒間隙中流過(guò)，較早地被沖洗出柱外，而小分子可滲透到凝膠孔隙里面去，較晚地被沖洗出來(lái)，混合物經(jīng)過(guò)凝膠色譜柱后就按其分子大小順序先后由柱中流出達(dá)到分離的目的。用凝膠滲透色譜的優(yōu)點(diǎn)是：分離不需要梯度沖洗裝置；同樣大小的柱能接受比通常液相色譜大得多的試樣量；試樣在柱中稀釋少，因而容易檢測(cè)；組分的保留時(shí)間可提供分子尺寸信息；色譜柱壽命長(zhǎng)。它的缺點(diǎn)是：不能分離分子尺寸相同的混合物，色譜柱的分離度低；峰容量小；可能有其他保留機(jī)理起作用時(shí)引起干擾。凝膠滲透色譜法為測(cè)定高聚物分子量和分子量分布提供了一個(gè)有效的方法，此外還可用來(lái)分離齊聚物、單體和聚合物添加劑等。⑤離子色譜法。采用柱色譜技術(shù)的一種高效液相色譜法，樣品展開方式采用洗脫法。根據(jù)不同的分離方式，離子色譜可以分為高效離子色譜、離子排斥色譜和流動(dòng)相離子色譜3類。高效離子色譜法使用低容量的離子交換樹脂，分離機(jī)理主要是離子交換。離子排斥色譜法用高容量的樹脂，分離機(jī)理主要是利用離子排斥原理。流動(dòng)相離子色譜用不含離子交換基團(tuán)的多孔樹脂，分離機(jī)理主要是基于吸附和離子對(duì)的形成。離子色譜儀由淋洗液貯存器、泵、進(jìn)樣閥、分離柱、抑制柱、電導(dǎo)檢導(dǎo)器和數(shù)據(jù)處理單元等組成。離子色譜儀最重要的部件是分離柱，裝有離子交換樹脂。抑制柱是抑制型離子色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將淋洗液轉(zhuǎn)變成低電導(dǎo)部分，以降低來(lái)自淋洗液的背景電導(dǎo)，同時(shí)將樣品離子轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的酸或堿，以增加其電導(dǎo)。分離陰離子，抑制柱填充強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂；分離陽(yáng)離子，抑制柱填充強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。檢測(cè)器分通用型檢測(cè)器與專用型檢測(cè)器。前者如電導(dǎo)檢測(cè)器，對(duì)檢測(cè)池中所有離子都有響應(yīng)；后者如紫外-可見分光光度計(jì)，對(duì)離子具有選擇性響應(yīng)。離子色譜法具有快速、靈敏、選擇性好和同時(shí)測(cè)定多組分的優(yōu)點(diǎn)。尤其對(duì)于陰離子的測(cè)定，離子色譜的出現(xiàn)是分析化學(xué)中的一項(xiàng)突破性的新進(jìn)展。離子色譜法主要用于測(cè)定各種離子含量，廣泛應(yīng)用于水、紙漿和漂白液、食品分析、生物體液、鋼鐵和環(huán)境分析等各個(gè)領(lǐng)域。設(shè)備高效液相色譜儀由輸出泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、梯度沖洗裝置、檢測(cè)器及數(shù)據(jù)處理和微機(jī)控制單元組成。輸出泵的功能是將沖洗劑在高壓下連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)，使混合物試樣在色譜中完成分離過(guò)程。常用的進(jìn)樣方式有3種：注射器隔膜進(jìn)樣、閥進(jìn)樣和自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。色譜柱的功能是將混合物中各組分分離。梯度沖洗又稱溶劑程序，通過(guò)連續(xù)改變沖洗劑的組成，改善復(fù)雜樣品的分離度，縮短分析周期和改善峰形，其功能類似于氣相色譜中的程序升溫。檢測(cè)器的功能是將從色譜柱中流出的已經(jīng)分離的組分顯示出來(lái)或轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號(hào)，主要有紫外吸收檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和折光示差檢測(cè)器，其中以紫外吸收檢測(cè)器使用最廣?，F(xiàn)代化的儀器都配有計(jì)算機(jī)，以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)處理數(shù)據(jù)、繪圖和打印分析報(bào)告第四篇：牛奶中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)——高效液相色譜法(SOP)修改版-新牛奶中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)—高效液相色譜法安全要求該檢驗(yàn)的提取、凈化步驟應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，操作中需著工作服、戴口罩手套，避免溶劑氣體吸入和皮膚接觸；廢棄的化學(xué)試劑收集到專用容器集中處理。急救措施皮膚觸到有機(jī)溶劑或酸,用清水清洗，濺入眼中用純水灌洗。適用范圍該操作規(guī)程適用于牛奶中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素殘留量的制樣及測(cè)定。職責(zé)進(jìn)行該項(xiàng)檢驗(yàn)的檢驗(yàn)員必須按該操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，質(zhì)量監(jiān)督員負(fù)責(zé)監(jiān)督該操作規(guī)程的正確執(zhí)行。檢測(cè)原理用乙腈提取試料中殘留的阿維菌素類藥物，加水稀釋，加三乙胺使溶液呈弱堿性，C18固相萃取柱凈化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定，外標(biāo)法定量。方法靈敏度本方法在牛奶中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的檢測(cè)限均為1μg/kg，定量限均為2μg/kg。注意事項(xiàng)7.1整個(gè)凈化步驟控制C18柱流速約在1～2mL/min；7.2C18柱使用過(guò)程中除特別說(shuō)明外，應(yīng)避免柱床干涸。材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為超純水。8.1阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品含量≥95.7%8.2多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品含量≥92.6%8.3伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品含量≥93.9%8.4乙腈色譜純8.5甲醇色譜純8.6三氟乙酸酐8.7三乙胺8.8異辛烷8.9N-甲基咪唑8.10C18固相萃取柱500mg/6cc，或相當(dāng)者8.11固相萃取柱洗滌液；取乙腈30mL、水70mL和三乙胺20XXL，混勻。8.12衍生化試劑a)A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）?，F(xiàn)用現(xiàn)配。b)B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）?，F(xiàn)用現(xiàn)配。8.131mg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別稱取阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，精密稱定，于10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度。配制成阿維菌素類藥物濃度為1mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20XX存，有效期6個(gè)月。8.1410μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.25mL，于25mL量瓶中,用乙腈稀釋并配制成阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素濃度為10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20XX保存，有效期1個(gè)月。8.151μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取10μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2.5mL，于25mL量瓶中,用乙腈稀釋配制成阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素濃度為1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20XX保存，有效期1個(gè)月。8.16高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器）8.17分析天平感量0.00001g8.18天平感量0.01g8.19振蕩器8.20XX心機(jī)8.21渦旋混合儀8.22聚丙烯離心管mL8.23氮吹儀8.24C18固相萃取柱500mg/6cc，或相當(dāng)者8.25微孔濾膜0.45μm檢驗(yàn)步驟9.1試料的制備9.1.1取混勻后的供試樣品，作為供試試料。9.1.2取混勻后的空白樣品，作為空白試料（陰性對(duì)照）。9.1.3取混勻后的空白樣品5g,添加1μg/mL的工作液0.05mL，作為空白添加試料。9.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取1μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.02、0.05、0.1mL，于10mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度；精密量取10μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.25mL，于50mL量瓶中，0.1、0.3mL至10mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成濃度分別為2、5、10、50、100、300ng/mL的阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0mL于各自的10mL試管中，于50℃水浴氮?dú)獯蹈?，按衍生化步驟處理后，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測(cè)定，從低濃度到高濃度依次測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3針。以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。9.3提取9.2.1稱取(5±0.05)g試料，于50mL離心管中，加乙腈8mL，渦旋混勻，中速振蕩5min，5000r/min離心10min。9.2.2收集上清液于另一50mL離心管中。殘?jiān)僦貜?fù)提取一次。9.2.3合并兩次上清液，加水15mL和三乙胺50μl，混勻，備用。9.4凈化9.4.1依次用乙腈5mL、固相萃取柱洗滌液5mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2將備用液過(guò)柱，抽干。加異辛烷3mL洗滌，抽干。9.4.3用乙腈5mL洗脫。收集洗脫液于10mL試管中，50℃下用氮?dú)獯蹈伞溆?.5衍生化向試管中依次加入衍生化試劑A液100μL和衍生化試劑B液150μL，密閉，渦動(dòng)10s，依次加冰醋酸、三乙胺各50μL，渦動(dòng)10s，密閉反應(yīng)30min，加650μL甲醇混勻。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜檢測(cè)。9.6測(cè)定9.6.1色譜條件9.6.1.1色譜柱：C18柱，（250×4.6mm，粒徑5μm）；或相當(dāng)者；9.6.1.2流動(dòng)相：乙腈+水（90+10，v/v）；9.6.1.3流速：1.8mL/min；9.6.1.4檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)：365nm，發(fā)射波長(zhǎng)：475nm；9.6.1.5柱溫：40℃；9.6.1.6進(jìn)樣量：20XXL。9.7測(cè)定法9.7.1試樣溶液和50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)校準(zhǔn)，以峰面積計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)，試樣溶液測(cè)定過(guò)程中應(yīng)參插注入標(biāo)準(zhǔn)溶液，以便準(zhǔn)確定量?？瞻?、添加、標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖見附錄及附加說(shuō)明。9.7.2試劑空白試驗(yàn)除不加試料外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。9.8結(jié)果計(jì)算和表述試料中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的殘留量（μg/kg），按下式計(jì)算：X=式中:X——試料中相應(yīng)的阿維菌素類藥物的殘留量，μg/kg；C——試樣溶液中相應(yīng)的阿維菌素類藥物的濃度，ng/mL；V——衍生化后試樣的總體積，mL；m——供試試料的質(zhì)量，g。注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。9.9結(jié)果判定CVm9.9.1線性范圍阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素在2～300ng/mL范圍考察線性，計(jì)算回歸方程，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995。9.9.2準(zhǔn)確度本方法在2～50μg/kg添加濃度的回收率為70～120XX。9.9.3精密度本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20XX9.9.4判定當(dāng)方法學(xué)考察結(jié)果符合上述規(guī)定時(shí)，供試組織中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的殘留量單個(gè)及之和Xi＜檢測(cè)限時(shí)，判定為未檢出；方法檢測(cè)限≤Xi＜最高殘留限量時(shí),判i1i1nn定為符合規(guī)定；Xi1ni≥最高殘留限量時(shí)，判定為不符合規(guī)定。注：僅當(dāng)Xi≥方法檢測(cè)限時(shí)，Xi為參與阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素總殘留量求和計(jì)算，故求和公式中0≤n≤3。9.10附錄及附加說(shuō)明阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素在牛奶中的最