細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

細(xì)胞培養(yǎng)的基本(jīběn)方法第一頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念2細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持(wéichí)其結(jié)構(gòu)和功能的一一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個(gè)細(xì)胞，也可以是細(xì)胞群。第二頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞培養(yǎng)的目的(mùdì)與用途2一、基礎(chǔ)研究(1)藥物作用(zuòyòng)機(jī)理(2)基因功能(3)疾病發(fā)生機(jī)理二、科學(xué)研究:(1)新藥篩選:如藥效研究,中藥有效成分篩選等.(2)疫苗研究與開(kāi)發(fā):如肝炎疫苗,艾滋病疫苗，腫瘤疫苗等.(3)基因工程藥物與細(xì)胞工程藥物的研究與開(kāi)發(fā)

(4)單克隆抗體制備第三頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞培養(yǎng)主要(zhǔyào)的設(shè)施器材2設(shè)施：超凈臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮儲(chǔ)存罐、冰柜、恒溫水浴槽、離心機(jī)、壓力蒸汽消毒器。器材：一、玻璃器材玻璃培養(yǎng)皿、刻度吸管、離心管、培養(yǎng)瓶等，（現(xiàn)已較少使用）。

二、塑料器材多孔培養(yǎng)板（6,12,24,48,96）、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、凍存管。三、橡皮器材橡皮制品（最好是硅制品）做各種瓶或試管的塞子(sāizi)、蓋子。四、金屬器材剪刀、鑷子、手術(shù)刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號(hào)針頭五、其他物品紗布、注射器、針頭、濾頭第四頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞培養(yǎng)的條件(tiáojiàn)（1）適宜的溫度和PH37℃，pH7.2~7.4。（2）氣體環(huán)境(huánjìng)95%空氣+5%CO2;適宜的濕度（無(wú)菌水不能干掉）。（CO2：細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的成分,pH值維持，最低不能低于1%。）（3）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)N源、C源、無(wú)機(jī)鹽、維生素、H2O，細(xì)胞培養(yǎng)基中含有。常用的細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199等。（4）無(wú)菌條件紫外消毒、空氣過(guò)濾、無(wú)菌濾頭，高壓滅菌、嚴(yán)格操作。第五頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt設(shè)施(shèshī)、器材、試劑實(shí)物圖第六頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)的分類按照是否貼壁：貼壁細(xì)胞：大多數(shù)屬此類細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。懸浮細(xì)胞：主要為取自血、骨髓(ɡǔsuǐ)、脾的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞。按照傳代次數(shù)：原代細(xì)胞：即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)而未經(jīng)傳代的細(xì)胞。（也有人把傳代10次之內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞。）細(xì)胞系：指原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體。如HeLa細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。第七頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt原代培養(yǎng)(péiyǎng)原理：將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械(jīxiè)方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)(péiyǎng)方法：消化培養(yǎng)(péiyǎng)法、組織塊培養(yǎng)(péiyǎng)法。第八頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt原代消化(xiāohuà)培養(yǎng)法（1）處理(chǔlǐ)組織：用Hanks液漂洗組織2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。

（2）剪切：將組織切成2~3毫米大小的塊，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培養(yǎng)皿中。（3）消化：置于37℃溫箱消化，每隔20分鐘搖動(dòng)一次。消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

（4）分離：用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊。低速（500~1000轉(zhuǎn)/分）離心收集細(xì)胞，棄上清。（5）加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分裝入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基。（6）培養(yǎng)：置于37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)。第九頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt原代組織(zǔzhī)塊培養(yǎng)法（1）剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉組織塊表面血污，剪成1mm3小塊。（2）擺布：將組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離(jùlí)以0.5cm為宜，每一25ml

培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。（3）輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上，注意翻瓶時(shí)勿另組織小塊流動(dòng)，蓋好瓶塞，置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時(shí)左右（勿超過(guò)4小時(shí)），使小塊微干涸。（4）培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，46度斜持培養(yǎng)瓶，向瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補(bǔ)加培養(yǎng)液。

第十頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的傳代細(xì)胞傳代的概念：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將原有細(xì)胞分成幾部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行(jìnxíng)培養(yǎng)，這個(gè)過(guò)程就稱為傳代（passage）。傳代(chuándài)方法：懸浮細(xì)胞傳代、貼壁細(xì)胞傳代。第十一頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的傳代懸浮細(xì)胞傳代：（1）收集細(xì)胞懸液；（2）離心（1000轉(zhuǎn)/分，2分鐘）；（3）棄上清；（4）加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；（5）按照適當(dāng)比例接種到新的培養(yǎng)皿；（6）補(bǔ)足(bǔzú)培養(yǎng)基；（7）放于溫箱培養(yǎng)。重懸分裝(fēnzhuānɡ)放入溫箱第十二頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的傳代貼壁細(xì)胞的傳代：（1）吸去陳舊培養(yǎng)基，并用PBS清洗細(xì)胞表面；（2）加入胰酶消化細(xì)胞；（3）加入新鮮(xīnxiān)培養(yǎng)基終止胰酶消化；（4）將細(xì)胞吹打下來(lái)，收集，離心；（5）棄上清；（6）加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；（7）按照適當(dāng)比例接種到新的培養(yǎng)皿；（8）補(bǔ)足培養(yǎng)基；（9）放于溫箱培養(yǎng)。終止(zhōngzhǐ)胰酶消化并吹打重懸分裝放入溫箱吸去舊培養(yǎng)基，PBS清洗加入胰酶消化第十三頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的換液懸浮細(xì)胞換液：收集(shōují)細(xì)胞懸液、離心、棄上清、加入新鮮培養(yǎng)基重懸、補(bǔ)足培養(yǎng)基?；蛘咧苯訌呐f瓶吸取一定細(xì)胞懸液加入新瓶，補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)基即可。貼壁細(xì)胞換液：棄去陳舊培養(yǎng)基、PBS清洗細(xì)胞表面、加入新鮮培養(yǎng)基。第十四頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的凍存懸浮細(xì)胞的凍存：（1）配制(pèizhì)凍存液（胎牛血清：二甲基亞砜9:1），每個(gè)凍存管需要凍存液1ml。（2）收集細(xì)胞懸液、離心、棄上清、用凍存液重懸細(xì)胞、分裝至凍存管中，并立刻放入凍存盒內(nèi)，放入-80℃冰箱，第二日轉(zhuǎn)存于液氮中。第十五頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的凍存貼壁細(xì)胞的凍存：（1）配制凍存液。（2）棄去陳舊培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞表面，胰酶消化，終止消化，吹打(chuīdǎ)細(xì)胞，收集懸液、離心、棄上清、用凍存液重懸細(xì)胞、分裝至凍存管中，并立刻放入凍存盒內(nèi)，放入-80℃冰箱，第二日轉(zhuǎn)存于液氮中。吸去舊培養(yǎng)基，PBS清洗加入胰酶消化終止胰酶消化并吹打第十六頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凍存的注意事項(xiàng)：（1）凍存液要最先配置。原因一：二甲基亞砜（DMSO）在加入血清時(shí)會(huì)產(chǎn)熱損傷細(xì)胞。原因二：如果先用血清重懸細(xì)胞，再加入DMSO，則局部DMSO濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷（DMSO在室溫下對(duì)細(xì)胞有害），影響日后的復(fù)蘇。（2）凍存時(shí)要求細(xì)胞狀態(tài)良好，最好是取對(duì)數(shù)期細(xì)胞凍存，以保證復(fù)蘇后的存活率。（3）最大限度的減少DMSO在室溫下和細(xì)胞接觸的時(shí)間。（4）凍存時(shí)要緩慢降溫（慢凍），用細(xì)胞凍存盒可以做到每分鐘降低1℃，細(xì)胞凍存盒應(yīng)先放在4℃預(yù)冷，以減少細(xì)胞和DMSO在室溫接觸的時(shí)間；如果沒(méi)有凍存盒，則采用程序(chéngxù)降溫法。（4℃冰箱40min，-20℃冰箱30-60min，置于-80℃過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮。）第十七頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的復(fù)蘇懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的復(fù)蘇方法一樣，區(qū)別在于復(fù)蘇后死細(xì)胞的清除方法。復(fù)蘇流程：（1）取一支(yīzhī)離心管，加入3ml的新鮮培養(yǎng)基備用。（2）取出凍存的細(xì)胞，于37℃的溫水中，1min之內(nèi)迅速融化。

（3）迅速將解凍后的細(xì)胞加入預(yù)先準(zhǔn)備好的離心管中，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘。（4）棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。（5）接種到培養(yǎng)皿（瓶）內(nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)基，放入溫箱培養(yǎng)。補(bǔ)足培養(yǎng)基放入溫箱重懸3ml新鮮培養(yǎng)基備用1min之內(nèi)解凍迅速倒入第十八頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的復(fù)蘇復(fù)蘇后死細(xì)胞的清除方法：懸浮細(xì)胞：細(xì)胞復(fù)蘇后，每2天按照(ànzhào)2:1或3:1的比例傳代一次，大約1周后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。貼壁細(xì)胞：細(xì)胞復(fù)蘇后6h（此時(shí)已有細(xì)胞貼壁），吸去培養(yǎng)基（含有大量死細(xì)胞），重新加入新鮮培養(yǎng)基。第十九頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)復(fù)蘇的注意事項(xiàng)（1）細(xì)胞復(fù)蘇原則：快速(kuàisù)融化（快融）。（2）盡量減少室溫下DMSO和細(xì)胞接觸的時(shí)間。①預(yù)先準(zhǔn)備好離心管并加入新鮮培養(yǎng)液；②在1分鐘之內(nèi)將細(xì)胞融化；③立刻將融化后的細(xì)胞倒入離心管中。（3）復(fù)蘇時(shí)，離心時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，1分鐘即可，長(zhǎng)時(shí)間離心會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，降低細(xì)胞存活率。（4）死亡的細(xì)胞應(yīng)盡快清除掉，否則會(huì)影響存活細(xì)胞的狀態(tài)。（5）如果復(fù)蘇不成功，更可能是因?yàn)閮龃婊虮４孢^(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題。第二十頁(yè)，共二十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)污染時(shí)的處理有細(xì)胞株留存的或可購(gòu)置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

（1）使用抗生素污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效(yǒuxiào)。（2）加溫處理將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)