葉綠體色素的提取分離和理化性質(zhì)

用漏斗過濾再加入3~5m95%乙醇研磨至糊狀向研缽中加入少量CaCO用漏斗過濾再加入3~5m95%乙醇研磨至糊狀向研缽中加入少量CaCO粉末，葉綠體色素提取液殘?jiān)?0ml95%?1_心、/擊

乙醇伸葉綠體色素的提取分離和理化性質(zhì)組員：陸文文劉亞麗劉三許麻桃霞羅娟娟班級(jí)：11生科3班日期：2013-11-19一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握葉綠體色素的提取方法；2掌握用紙層析法提取葉綠體色素；3掌握葉綠體色素的部分理化性質(zhì)。二實(shí)驗(yàn)原理：葉綠體中的葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素不溶于水，但可溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇等有機(jī)溶劑提取。薄層層析色譜法是將吸附劑均勻涂在玻璃板上成一薄層。把待分離的樣品溶液點(diǎn)在薄層板的下端并把薄層板下端浸入展開劑中后，展開劑通過毛細(xì)管作用由下而上逐漸浸潤(rùn)薄層板，并帶動(dòng)樣品在板上也向上移動(dòng)，樣品在吸附劑和展開劑之間不斷地吸附脫附。由于吸附劑對(duì)樣品中不同成分的吸附能力不同，從而使各成分有不同的移動(dòng)速度而彼此分離。將提取的葉綠素溶液置于光下，在透射光呈綠色，在反射光下呈櫻桃紅色，這種現(xiàn)象稱為熒光現(xiàn)象。在反射光下葉綠素溶液之所以呈櫻桃紅色，是因?yàn)槿~綠色分子吸收光能后處于激發(fā)狀態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它回到基態(tài)時(shí)，將所獲得的能量以輻射能的形式發(fā)射出紅光量子。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光、高溫等的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅后，其中的氫(H+)又被銅(Cu2+)取代，形成了銅代葉綠素，便由褐色轉(zhuǎn)變成藍(lán)綠色，銅代葉綠素很穩(wěn)定，且比原來的綠色還要穩(wěn)定些，在光下也不易被破壞。三實(shí)驗(yàn)材料和儀器：材料新鮮的菠菜或小白菜等其他綠色植物葉片。設(shè)備電子天平、研缽、燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、刻度試管、試管夾、試管架、酒精燈、剪刀、圓形濾紙、小漏斗等。試劑丙酮、四氯化碳、無水硫酸鈉、6?mol/L鹽酸、醋酸銅粉末、碳酸鈣等。四實(shí)驗(yàn)步驟：葉綠體色素的提取

葉綠體色素的分離紙層析分離法紙層析裝置如圖所示。具體操作為：（具體操作為：（1）先用濾紙條（2）取一張圓形層析濾紙（直徑11cm，略大于培養(yǎng)皿直徑），在其中心位置鉆一個(gè)紙芯粗度的圓形小孔（濾紙不能折疊），將卷好的紙芯一端插入孔內(nèi)少許，并剪去紙芯上端多余部分，使紙芯上端與濾紙恰好平齊，下端長(zhǎng)約1.5cm（與培養(yǎng)皿蓋高度同）。（3） 把這個(gè)帶紙芯的圓形濾紙，平放在干凈的培養(yǎng)皿上，用細(xì)玻璃滴管吸取少量葉綠體色素的丙酮提取液，小心地滴入紙芯上端7-10滴。注意：一定要在色素斑點(diǎn)稍風(fēng)十后，再滴入另一滴，而且液滴不能污染濾紙。（4） 向培養(yǎng)皿中倒入適量（約為培養(yǎng)皿高度的1/3左右）四氯化碳，并加入一勺（適量）的無水硫酸鈉，使紙芯下端浸入其中，并立即蓋上培養(yǎng)皿。此時(shí)，推動(dòng)劑借毛細(xì)管引力順紙芯擴(kuò)散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動(dòng)，數(shù)分鐘后，就可見到濾紙上出現(xiàn)四或五個(gè)顏色不同的同心環(huán)，并逐漸擴(kuò)大。（5） 當(dāng)推動(dòng)劑前沿接近濾紙邊緣時(shí)（約30min左右），取出濾紙，即可看到分離的各種色素，用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱，并繪簡(jiǎn)圖示之或拍攝圖片。葉綠體色素的理化性質(zhì)（1） 熒光現(xiàn)象觀察葉片丙酮提取液（稀釋前的濃提取液）在反射光和透射光下的顏色有何不同并拍攝圖片。葉綠體色素溶液在反射光下呈櫻桃紅色，在透射光下呈綠色，說明原因。（2） 光對(duì)葉綠素的破壞作用取葉綠體色素提取液少許，分裝2支試管中，一支放在黑暗處（或用黑紙遮光）；另一支放在強(qiáng)光下（陽光直射），經(jīng)0.5~1h后，觀察2支試管中溶液顏色有何不同并拍攝圖片。（3） 氫和銅對(duì)葉綠素中鎂的取代作用a、 取2個(gè)試管，A管中加入稀釋后的葉綠體色素提取液2mL，作為對(duì)照；在B管中加入稀釋后的葉綠體色素提取液5mL并加入1~2滴濃鹽酸，搖勻，溶液變?yōu)楹稚?，拍攝圖片，此時(shí)葉綠素中的鎂（Mg2+）被氫（H+）取代而生成了去鎂葉綠素。b、 從B管中分出一半裝人C管，作為對(duì)照，在B管余下的溶液中加入一小粒醋酸銅結(jié)品，將B管和C管都在酒精燈上慢慢加熱，則B管中的溶液又轉(zhuǎn)變?cè)谒{(lán)綠色，拍攝圖片，這是因?yàn)槠渲械臍洌℉+）又被銅（Cu2+）取代，形成了銅代葉綠素。以葉綠素a為例，反應(yīng)過程如下：

XOOCHi/CgzHxQN.MgCOOC20H39XOOCHi/CgzHxQN.MgCOOC20H39葉綠素a（綠色）+2H*—*,C32H30ON4H2 +Mg2coocg/COOCHaC32H30ON4H2 +Cu五實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析頃"去鎂葉綠素（褐色）1.葉綠體色素的分離COOCHj■C32H/COOCHaC32H30ON4H2 +Cu五實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析頃"去鎂葉綠素（褐色）1.葉綠體色素的分離COOCHj■C32HJ0ON4Cii 土2H*鋼代葉綠素（跋爆色）胡蘿卜素葉黃素1臨綠也■胡蘿卜素葉黃素葉綠素b（槌黃悒）分析：葉綠體中的色素有葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素。這些色素的顏色（如圖2）。2.葉綠體色素的理化性質(zhì):（1）熒光現(xiàn)象圖5理論圖像圖5理論圖像分析：葉綠素和類胡蘿卜素吸收紅橙光和藍(lán)紫光，把綠光絕大多數(shù)都反射了出去，所以當(dāng)觀察透射光時(shí)，我們看到的色素是綠色的；在反射光下葉綠素溶液之所以呈櫻桃紅色，是因?yàn)槿~綠色分子吸收光能后處于激發(fā)狀態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它回到基態(tài)時(shí)，將所獲得的能量以輻射能的形式發(fā)射出紅光量子（如圖4）。（2）光對(duì)葉綠素的破壞作用強(qiáng)光照?qǐng)D6強(qiáng)光照?qǐng)D6黑暗分析：葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光、高溫等的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。所以在強(qiáng)光照下的左邊試管中色素呈棕黃色，而黑暗環(huán)境中沒接受光照的右邊試管色素呈綠色。2.3氫和銅對(duì)葉綠素中鎂的取代作用A2.3氫和銅對(duì)葉綠素中鎂的取代作用AB圖7分析：葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅后，其中的氫（H+）又被銅（Cu2+）取代，形成了銅代葉綠素，便由褐色轉(zhuǎn)變成藍(lán)綠色，銅代葉綠素很穩(wěn)定，且比原來的綠色還要穩(wěn)定些，在光下也不易被破壞。六、注意事項(xiàng)：（1） 研磨葉片要充分，否則提取的葉綠體色素溶液濃度稀，熒光現(xiàn)象不明顯。（2） 紙層析時(shí)，紙芯一定要卷實(shí)，分離色素用的圓形濾紙?jiān)谥行拇虻男A孔周圍必須整齊，否則分離的色素不是一個(gè)同心圓。（3） 色素的提取、展層均應(yīng)在弱光或暗室內(nèi)綠光下進(jìn)行，以防止光破壞色素，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（4） 實(shí)驗(yàn)用的有機(jī)溶劑較多，且都易揮發(fā)，取時(shí)動(dòng)作要快、取后要隨時(shí)加蓋。七【思考題】（1） 圖示葉綠體色素紙層析結(jié)果，用鉛筆分別標(biāo)出葉綠素a和葉綠素4葉黃素、胡蘿卜素。（2） 研磨提取葉綠體色素時(shí)加入CaCO3和石英砂各有什么作用？答：加入碳酸鈣為了保護(hù)色素，加入石英砂為了研磨更加充分。（3） 根據(jù)Cu2+在葉綠素分子中的替代作用，對(duì)制作綠色標(biāo)本有何指導(dǎo)意義？答:鎂離子被銅離子取代后綠色會(huì)更加穩(wěn)定，這樣可以用于一些植物標(biāo)本的保存。八實(shí)驗(yàn)心得：通過這次試驗(yàn)，我們了解到了葉子中的各種主要色素，并學(xué)會(huì)了一種新的方法一一薄層層析色譜法，并了解到了葉綠素的不穩(wěn)定性，并從中提升了對(duì)生物的興趣，薄層層析色譜法相對(duì)于我們中學(xué)學(xué)的紙層析法，結(jié)果更為準(zhǔn)確，現(xiàn)象更為明顯，也更能說明葉子匯總的各種色素。還了解到