葉綠體色素的提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告

葉綠體色素的提取、分離、定量及理化性質(zhì)的鑒定生命科學(xué)學(xué)院09生科基朱文杰實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆仗崛『头蛛x葉綠體色素的方法;掌握測(cè)定葉綠體色素含量的方法；熟悉葉綠體色素的理化性質(zhì)及吸光特性；了解植物葉綠體色素組成及其與生境的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)原理：葉綠體色素是吸收光能的重要物質(zhì)，包括葉綠素和類胡蘿卜。利用不同色素的極性不同可以用色譜分離法將其分離。不同的色素對(duì)光的吸收范圍不同，因此我們也可以測(cè)量不同色素在不同波長(zhǎng)光下的吸光值，即可用公式計(jì)算出其中各色素的含量。光對(duì)葉綠體色素有破壞作用，將葉綠體色素暴露于強(qiáng)光下，可以發(fā)現(xiàn)葉綠素被破壞，溶液顏色變化。。葉綠體色素分子吸收光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，如能量不被光合作用利用，激發(fā)態(tài)變回到基態(tài)，放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅光。葉綠素分子中卟啉環(huán)上的Mg處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，可被H、Cu、Zn離子取代。葉綠素不溶于水，能溶于有機(jī)溶劑，且各色素的脂溶性不同，故可利用乙醇或丙酮提取，用不同的有機(jī)溶劑萃取或用色譜法進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)步驟：分別選取2g左右新鮮菠菜和0.2g左右玉米幼株的葉片剪碎放入研缽中。在研缽中加入5ml丙酮以及少量的石英砂和氯化鈣，充分研磨至無(wú)纖維裝組織。過濾并轉(zhuǎn)移動(dòng)全量筒中，再用3ml丙酮沖洗研缽，最后加入丙酮定容至10ml作為備用提取液。實(shí)驗(yàn)一：吸光值測(cè)定：取0.1ml色素提取液，用80%丙酮稀釋到3ml，測(cè)定663、645nm處的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b的含量。Chla(gg/ml)T2.7OD—2.69OD645,Chlb(gg/mD=22.98545—4瓦0。663。實(shí)驗(yàn)二：光破壞：取少量色素提取液并稀釋3到5倍，分為2份，一份至于暗處，一份正對(duì)觀察透射光，反身觀察反射光，最后放在培養(yǎng)箱中的強(qiáng)光下放置2H。實(shí)驗(yàn)三：銅帶反應(yīng)：取少量色素提取液少許于試管中，一滴一滴加濃鹽酸，直全溶液顏色出現(xiàn)褐綠色。然后加醋酸銅品體少許，慢慢用水浴加熱溶液，則又產(chǎn)生鮮亮的綠色。實(shí)驗(yàn)四：皂化反應(yīng)取葉綠體色素提取液2mL于大試管中，加入4mL乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加人3mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻。待溶液分為兩層后用滴管吸取上層綠色層溶液，放入另一試管中，再用蒸餾水沖洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30%KOH一甲醇溶液，充分搖勻，再加入蒸餾水約3-5mL，搖勻靜置。實(shí)驗(yàn)五：葉綠體色素分離：圓盤分離：取圓形定性濾紙一張，用毛細(xì)管吸取葉綠體色素提取滴在圓形濾紙中心點(diǎn)樣20次左右，在圓形濾紙中心戳一圓形小孔，將紙捻成燈芯狀，一端插入圓形濾紙的小孔中，再往培養(yǎng)皿中加入適量的四氯化碳，使紙捻下端浸入推動(dòng)劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿。條帶分離：取條形濾紙一張，在離一端1cm左右處用鉛筆輕輕劃線。再用毛細(xì)管吸取色素提取在細(xì)線處劃線。將紙條的另一端用大頭釘釘在玻璃管橡皮塞上。長(zhǎng)度為蓋上橡皮塞濾紙下部剛好觸底為宜。最后向管中加入四氯化碳蓋上塞子，注意不要使液面高于鉛筆劃線處。實(shí)驗(yàn)五：不同色素吸光值測(cè)定：將條形濾紙上的條帶剪下來(lái)放入不同小試管中，均用80%丙酮洗脫后，最為分光光度計(jì)觀測(cè)的預(yù)備液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)一：吸光值測(cè)定項(xiàng)目OD663OD645Chla(gg/ml)Chlb(gg/ml)稀釋倍數(shù)鮮重（g）菠菜0.3530.1234.1523.615302玉米0.3590.0964.3010.51850.2由公式計(jì)算有〔Chla(gg/ml)=12.7OD663-2.69OD645,Chlb(gg/ml)=22.9OD645-4.68OD663)Chlb(gg/ml)*0.1*30*10/2Chlb(Chlb(gg/ml)*0.1*30*10/2Chlb(gg/ml)*0.6*5*10/0.2玉米：Chla(gg/ml)*0.6*5*10/0.2菠菜（od玉米（od值）菠菜（od玉米（od值）值）400nm0.424410nm0.53420nm0.577430nm0.688440nm0.609450nm0.467460nm0.447470nm0.397480nm0.267490nm0.127500nm0.047510nm0.007520nm-0.003530nm-0.004540nm-0.003550nm-0.002560nm0.003570nm0.019580nm0.025590nm0.028600nm0.036610nm0.056620nm0.063630nm0.055640nm0.083645nm0.1230.096650nm0.169660nm0.319663nm0.3530.359670nm0.251菠菜總?cè)~綠素吸光光譜菠菜（od值）菠菜（od值）680nm 0.044690nm -0.022700nm -0.034實(shí)驗(yàn)二：光破壞位于暗處的葉綠素提取液依然保持鮮綠色，置于強(qiáng)光下的葉綠色提取液最后呈暗橙黃色。這是因?yàn)槿~綠素在光下接受電子會(huì)迅速?gòu)幕鶓B(tài)竄升至激發(fā)態(tài)，雖然還會(huì)馬上回落成基態(tài)，但這個(gè)過程中會(huì)有90%的能量以熱能的形式散失掉，并用剩余的10%左右的能量發(fā)出紅色的熒光。經(jīng)過一段時(shí)間的陽(yáng)光照射，能量達(dá)到一定程度的損失，使剩余的能量所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)不足以發(fā)出綠光，只夠發(fā)出黃光.實(shí)驗(yàn)三：銅帶反應(yīng)當(dāng)往葉綠素提取液中加入濃HCL時(shí)，葉綠素分子將受到破壞。主要是鎂離子的缺失而形成去鎂葉綠素，在加入銅離子并水浴加熱的過程中，我們能看見液體重新恢復(fù)亮綠色。此時(shí)是因?yàn)殂~離子與缺鎂葉綠素結(jié)合而產(chǎn)生了銅帶葉綠素。ch2 ch2CH CHII IIc——ch3 c——ch3(CH2)3 (CH2)3HC—CH3 HC—CH3(CH2)3 (CH2)3HC—CH3 HC——CH3(CH2)3 (CH2)3CH CHCH3 CH^CHaChlorophylla Chlorophyllb實(shí)驗(yàn)四：皂化反應(yīng)第一次加入乙醚搖勻，再加入蒸餾水后，由于葉綠素分子溶于有機(jī)溶液的特性。我們可以看到溶液分為2層，上面為溶解有葉綠素的乙醚層，故為綠色。下層為水層，為白色或淺黃色。加入30%KOH一甲醇溶液后，葉綠素可與堿起皂化反應(yīng)而形成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水，而類胡蘿卜素不能發(fā)生皂化反應(yīng)，其依然為脂溶性。故加入蒸餾水后下層為水層，為綠色，上層為黃色。實(shí)驗(yàn)五：葉綠體色素分離圓盤分離：我們?cè)趫A形濾紙上能看見4條清晰的環(huán)帶，由于葉綠素與類胡蘿卜素的基團(tuán)不同，極性不同，所以遷移的速率也不同。從內(nèi)到外依次為葉綠素B、葉

綠素A、葉黃素、胡蘿卜素。具體見附圖（一）。條帶分離：如上，我們可以看見從劃線處往上有4條清晰地條帶，從下到上依次為葉綠素B、葉綠素A、葉黃素、胡蘿卜素。將測(cè)量數(shù)據(jù)制表如下葉綠色素a葉綠色素b胡蘿卜素葉黃素400nm0.6630.2540.0220.05410nm0.8570.2240.0330.062420nm0.8820.3740.0340.076430nm1.0320.4460.0430.089440nm0.7190.4260.0540.097450nm0.3010.4870.0430.096460nm0.2160.5730.0350.087470nm0.2160.3970.050.082480nm0.160.1820.0420.078490nm0.0930.0790.0220.043500nm0.0590.060.0050.019510nm0.0560.050.0010.006520nm0.0560.04700.001530nm0.0620.05200.001540nm0.0560.054-0.0010550nm0.0590.055-0.002-0.001560nm0.0670.057-0.0010570nm0.0970.062-0.002-0.001580nm0.1140.08700.001590nm0.1090.08200.002600nm0.1240.08800.002610nm0.1730.0880.0020.005620nm0.1850.08700.003630nm0.1580.09900.003640nm0.1640.17-0.0020.003645nm0.2150.230.0010.006650nm0.3180.250.0020.01660nm0.7290.2270.0140.025663nm0.8090.2230.0180.029670nm0.650.1490.0090.019680nm0.180.054-0.0020690nm0.0390.014-0.006-0.007700nm0.