抗體的人工制備

關(guān)于抗體的人工制備第1頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三[目的與要求]1、掌握單克隆抗體和多克隆抗體的概念、制備原理及其制備的具體過程。

2、了解基因工程抗體與催化抗體的概念及意義。[難點與重點]

重點與難點：單克隆抗體和多克隆抗體的概念、制備原理及其制備的具體過程。

第2頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三為了研究抗體的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)與功能，及應用抗體于臨床疾病的診斷、治療及預防都需要人工制備抗體。目前，根據(jù)制備的原理和方法可分為四類：多克隆抗體

單克隆抗體

基因工程抗體催化抗體第3頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

大多數(shù)天然抗原物質(zhì)(如細菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等)往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機體產(chǎn)生一種特異性抗體。

多克隆抗體：多個抗原決定簇刺激機體后，由多個免疫淋巴細胞分泌的多種抗體的混合物。第1節(jié)多克隆抗體一、概念第4頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三二、多克隆抗體制備的基本過程試血測定抗體效價血清的分離與保存多抗的純化與標記多抗的親和層析抗體的保存緩沖體系防腐劑穩(wěn)定劑濃度存儲時間第5頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三（多頭加樣槍）排槍ELISA板第6頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三96孔細胞培養(yǎng)板第7頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第9頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)單克隆抗體第10頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三一、單克隆抗體的概念1、概念：由一個B細胞分化增殖的子代細胞(漿細胞)產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體。2、特點：抗體的重鏈、輕鏈及其V區(qū)獨特型的特異性、親和力、生物學性狀及分子結(jié)構(gòu)均完全相同。第11頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三這種雜交瘤細胞：既具有骨髓瘤細胞能大量無限生長繁殖的特性，又具有抗體形成細胞合成和分泌抗體的能力。第12頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三10:1第13頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三雜交瘤細胞一般采用HAT選擇培養(yǎng)基進行初篩，培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤（Hypoxanthine，H）、氨基喋呤（Aminoopterin，A）及胸腺嘧啶（Thymidine，T），利用A阻斷核酸的主要生物合成途徑。代謝缺陷型細胞株缺失旁路DNA合成所需的酶——次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用外源性的核苷酸前體，如H和T，喪失DNA合成的旁路途徑；只能通過以葉酸為媒介，由氨基酸和其它小分子化合物合成核苷酸進行DNA合成。一旦葉酸衍生物的合成被HAT培養(yǎng)液中的A阻斷，這些細胞因為失去DNA合成的主通道，又無能力從旁路合成DNA而死亡。正常細胞在H和T存在的情況下，可利用旁路途徑繼續(xù)合成核酸。小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞株為代謝缺陷型細胞株，融合后在HAT培養(yǎng)基中不能生長，而融合細胞由于含有來自正常細胞的HGPRT酶，在HAT培養(yǎng)基中可以存活。單克隆抗體的制備過程：第14頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三在細胞內(nèi)DNA合成一般有兩條途徑，主途徑是在細胞內(nèi)由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，而氨基喋呤可以阻斷此途徑。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤細胞的DNA合成沒有此輔助途徑。第15頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三在用HAT選擇培養(yǎng)1～2d內(nèi)，將有大量瘤細胞死亡，3～4d后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10d后應換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3d換一半培養(yǎng)液。單克隆抗體的制備過程：第16頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三（1）天然抗原的制備；（2）免疫動物的確定、免疫劑量及免疫次數(shù)的確定；（3）骨髓瘤細胞的準備；（4）小鼠采血測定抗體效價；（5）小鼠脾細胞的制備及飼養(yǎng)細胞的制備；（6）小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞的融合；（7）陽性雜交瘤細胞的篩選；（8）抗體的篩選；（9）陽性雜交瘤細胞腹腔注射小鼠，大量制備單克隆抗體。單克隆抗體的制備過程：第17頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第18頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三在細胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養(yǎng)細胞（Feedercells）。飼養(yǎng)細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。飼養(yǎng)細胞第19頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

細胞密度過低不利于細胞生長繁殖常用小鼠腹腔細胞作飼養(yǎng)細胞其中還有清除死亡細胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化飼養(yǎng)細胞：腹腔巨噬細胞或脾細胞第20頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三免疫脾細胞-漿母細胞，處于增殖狀態(tài)的B細胞。漿母細胞又稱原漿細胞，為未成熟的漿細胞前體。漿細胞：能夠合成和分泌免疫球蛋白的終末分化階段的B細胞。正常機體漿細胞存在在脾、淋巴結(jié)的相應組織結(jié)構(gòu)處。

第21頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三B淋巴細胞的增殖分化：原B細胞

前B細胞

不成熟B細胞

成熟B細胞出現(xiàn)膜型IgM出現(xiàn)IgM，IgD在骨髓中：抗原刺激漿母細胞（免疫脾細胞）漿細胞，存在時間短，2-3d分泌抗體記憶型B細胞，表達膜型Ig，存活幾周或幾個月抗原刺激較高水平免疫應答高親和力識別抗原抗原刺激更高親和力第22頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三注意免疫學相關(guān)知識：1、免疫小鼠的日齡及性別：

SPF

Balb/c小鼠，6～12周齡，體重為18~22g，雌性（便于操作），分成3組，每組4只

。2、免疫程序：一免，二免（15d），三免(29d)。3、免疫方式：體內(nèi)免疫：免疫原性強、來源充分的抗原體外免疫：免疫原性很弱或?qū)C體有害（如引起免疫抑制）的抗原。第23頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

體外免疫：將脾細胞（或淋巴結(jié)細胞，或外周淋巴細胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細胞進行融合。

其基本方法：取4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟，制成單細胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗滌2～3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5～5ug/ml，細胞抗原105～106

個細胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養(yǎng)上清液；37℃5%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。第24頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三4、免疫途徑：最常用腹腔多點注射。常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者。5、免疫佐劑：首免，弗氏完全佐劑（油包水的乳濁液，含有結(jié)合分枝桿菌的細胞壁成分）；等體積

二免、三免，弗氏不完全佐劑（不含結(jié)合分枝桿菌）。等體積注意免疫學相關(guān)知識：第25頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三腹腔注射第26頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三3、優(yōu)點（1）制備時不需純化抗原就可得到純抗體；

（2）有很高的效價（3）有高度的單一性、均一性；

（4）產(chǎn)量高，且可連續(xù)生產(chǎn)。第27頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三5、單克隆抗體的應用（1）診斷試劑：用于各種病原體以及腫瘤的診斷。避免了多克隆抗體的交叉反應（2）治療試劑：獸醫(yī)臨床上傳染病的治療；醫(yī)學臨床上抑制器官移植排斥、治療自身免疫疾病、制備生物導彈。（3）檢測試劑：各種病原體毒力因子的檢測；各種免疫細胞及其它組織細胞表面分子的檢測。（4）抗原純化：利用單克隆抗體的特異性，可將單克隆抗體與瓊脂糖等偶聯(lián)制成親和層析柱，可從混合組分中提取某種抗原成分。

制備疫苗第28頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三“生物導彈”是免疫導向藥物的形象稱呼，它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動導向，在生物體內(nèi)與特定目標細胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。第29頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

自1975年單克隆抗體雜交瘤技術(shù)問世以來，單克隆抗體在醫(yī)學中被廣泛地應用于疾病的診斷及治療。但目前絕大數(shù)單克隆抗體是鼠源的，臨床重復給藥時體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體，使臨床療效減弱或消失。因此，醫(yī)學臨床上最理想的單克隆抗體應是人源的,但人-人雜交瘤技術(shù)目前尚未突破。第三節(jié)基因工程抗體第30頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

目前較好的解決辦法是能研制基因工程抗體，以代替鼠源單克隆抗體用于臨床?；蚬こ炭贵w興起于80年代早期，是利用DNA重組技術(shù)，在分子水平對抗體基因進行切割、拼接或修飾，或人工合成后導入受體細胞表達，從而產(chǎn)生的新型抗體，也稱為第三代抗體。

研究成功的基因工程抗體有：嵌合抗體、重構(gòu)抗體、小分子抗體等。第31頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三一、概念利用基因工程技術(shù)制備的抗體分子。

按人類設(shè)計所重新組裝的新型抗體分子，可保留或增加天然抗體的特異性和主要生物學活性，去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu)(如Fc片段)，從而可克服單克隆抗體在臨床應用方面的缺陷(如鼠源單克隆抗體在人體內(nèi)使用會引起抗體產(chǎn)生而降低其效果，F(xiàn)c片段的無效性和副作用)，更具有廣闊的應用前景。二、特點第32頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三嵌合抗體(chimericantibody)是指在同一抗體分子中含有不同種屬來源抗體片段的抗體，又稱雜種抗體。第33頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三重構(gòu)抗體：將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab骨架區(qū)的編碼基因中，再將此DNA片段與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細胞，使之表達嵌合的V區(qū)抗體。第34頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

單鏈抗體(single-chainantibody)又稱Fv分子，由VL區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)肽連接物(1inker)連接而成。第35頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三噬菌體抗體：將抗體可變區(qū)基因與編碼噬菌體外殼蛋白的基因融合而成的一種基因工程抗體。催化抗體

(catalyticantibody)

：也叫抗體酶(abzyme)，是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性。第36頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第四節(jié)催化抗體一、催化抗體的概念

催化抗體(catalyticantibody)也叫抗體酶(abzyme)，是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性。

抗體制備技術(shù)的開發(fā)預示著可以人為生產(chǎn)適應各種用途的，特別是自然界不存在的高效的催化劑，對生物學、化學和醫(yī)藥等多種學科有重要的理論意義和實用價值。第37頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三二、催化抗體的制備

目前，催化抗體的制備采用化學和免疫相結(jié)合的方法，首先模擬酶作用于底物時的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，化學合成相應的類似物，即半抗原，用以免疫動物，再用單克隆技術(shù)，篩選獲得單克隆抗體。

對催化抗體的研究，開創(chuàng)了一條人工設(shè)計酶的新途徑，為尋找新型、高效、高選擇性催化劑創(chuàng)造了條件。第38頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1、細胞融合法首先通過化學反應合成反應物的過渡態(tài)類似物（通常是半抗原），經(jīng)