實驗九十 酶聯(lián)免疫吸附試驗

實驗九酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA

實驗十IgG的分離和純化程燕2014年6月9日實驗九酶聯(lián)免疫吸附試

（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）實驗目的1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、種類和用途。

2.學習用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾心法檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。

3.了解HBsAg陽性的意義。實驗原理用酶來標記抗原或抗體的免疫分析分析技術。由于酶的高效生物催化作用，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗法。實驗原理

將已知抗體（或抗原）結合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時將待檢標本和酶標抗體（或酶標抗原）按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體（或抗原）發(fā)生反應，用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進行定性或定量測定。

實驗原理ELISA的基本原理有三條：

（1）抗原或抗體能以物理性（疏水性）地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學活性；（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；（3）酶結合物與相應抗原或抗體結合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。

實驗原理常用酶聯(lián)免疫吸附試驗有間接法競爭法雙抗體夾心法ELISA-間接法此法是檢測抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測血清(抗體)與之結合，洗滌后，加酶標抗體和底物進行測定。其原理見圖。

酶標抗體固相抗原待測抗體EEE

ELISA間接法示意圖底物用于抗原及半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測抗原和一定量的已知酶標抗原，使二者競爭地與固相抗體結合，經(jīng)過洗滌分離，最后結合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關。固相抗體EEE酶標抗原待測抗原E底物E顯色反應（弱）固相抗體EEE酶標抗原底物顯色反應（強）EEEEEEELISA-競爭法

EL顛IS暗A-雙抗摟體夾內(nèi)心法雙抗樂體夾顆心法潤常用尤于檢回測抗榆原。將已窯知抗棕體吸道附于圍固相肯載體楊，加夸入待今測標姓本(含相汽應抗佩原)與之教結合至，溫旦育后善洗滌媽，加塊入酶青標抗嚷體及乏底物盡溶液狹進行角測定扣。酶標抗體固相抗體待測抗原EEE

雙抗體夾心法檢測抗原實驗幸材料1、乙欄型肝哪炎病惠毒表具面抗留原診江斷試枕劑盒定性夏檢測哄人血斜清或屑血漿露中的更乙型何肝炎許病毒帖表面赴抗原HB盞sA馳g。包括日：HB形sA召g特異竊性抗四體（鏡一抗倡）已流包被撇于酶賞標板玻上HB膏sA謹g陰、讀陽性忠血清臭各1份、酶標菊抗體織（二差抗）1份，顯色竄劑A、B各1份，酬終止和液1份，棵洗滌追液1份，2、待削檢血折清5份3、微竄量加犧樣器顆（10擱-1瀉00悠ul）及召匹配通的槍跑頭4、廢槍液缸注意會：有傅污染圣性。夾心誼法檢同測HB但sA欠g方法由于捕抗體1已包吵被在棵酶標湖板上太，故料直接待從加瞎抗原駛開始章。1、加省樣：每組2條8孔，掙待檢8孔，勉陰性驅(qū)對照鞏、陽察性對照、空白灣對照恢各1孔。盟分別國加75硬ul待測撲樣本淹和陰攻、陽曉性對沃照于沫相應旬孔內(nèi)公，蓋帽封板劇膜，愧置37稈℃恒溫類箱溫醋育60分鐘言。2、加館酶標幅抗體糞：除空撞白對竿照孔驅(qū)外，廊每孔催加1滴酶勾標溶催液，重混勻望后封舍板，雁置37啞℃水浴物箱溫患育30分鐘國。3、洗斥滌：用洗剪滌液例（按說頃明配暮制）注刷滿各猛孔，惕靜置20秒，伸甩去收洗滌掏液，鋸重復4次，因最后你一次挽在吸宵水紙匆上拍枕干。4、顯盲色：每孔忽加底椅物液A、B各1滴（50唉ul），育輕拍漠混勻養(yǎng)，置37羽℃避光洲顯色30分鐘惑，肉鹽眼觀川察。5、終受止：每孔馳加終感止液1滴（50殿ul），掙輕拍瞧混勻損。在10分鐘草內(nèi)酶嗎標6、測謎定：用酶繭標儀接（波嶺長45割0n藍m）測僻定各卷孔吸友光度OD值。酶：冷辣根約過氧丹化物悟酶(H緩RP予)底物等：3,凳3‘崖,5斃,5蕉’-四甲脾基聯(lián)騾苯胺隨（TM誤B）在辣快根過壇氧化損物酶取催化聚下，TM男B會產(chǎn)旁生可吸溶性掏藍色縫產(chǎn)物經(jīng)。使字用2M脈H2SO4終止丹反應證，在45鞏0n佳m測定揭吸光藍度。結果凱判斷1、定苗性：夾心單法EL刑SI封A中，遞陽性血孔呈劈燕色深廟于陰勻性孔戰(zhàn)。2、P/怕N值≥2.致1者判共為HB傳sA婦g陽性碗；P/著N值＜2.睜1者判渠為陰踏性。樹介于修中間認為可倡疑。S：待駕測樣逐本OD值CO并V：cu啦t-陡of督f罰va視lu茶e疼=N繭Cx油+0宣.1聚00NC喚x：陰導性對撒照OD值的尿均值陽性是判定眨值=S適/C藥OV≧1.底0：陽塑性﹤1套.0：陰地性實驗承報告1、計棋算5個待潤測樣突本的S/剛CO烤V，判瘦斷結浙果2、本禿實驗萬中采壺用的和酶、辦底物粱及反竹應原留理。實驗民十Ig溝G的分制離和店純化實驗猜目的實踐Ig鍬G分離搭純化育過程了解湖分離好、純出化抗塌體的廊原理比較石成年隆牛血次清與槐新生臂牛血旨清中Ig敘G的含測量（瞎眼觀宗）實驗排原理利用夸蛋白始質(zhì)鹽誘析原狀理，鞋分離泥血清遍中的Ig節(jié)G:不同席蛋白救質(zhì)在略同一梨濃度借鹽溶密液中哭的溶樸解度淋不同仍，因等此，吊可利寨用不吉同濃成度的能鹽溶舊液使度血清東中的掏各個捧蛋白避質(zhì)成楚分分畫別析筒出。血清發(fā)蛋白曠質(zhì)：液復雜睜混合典物。1、白沸蛋白柿、a1、a2、β球蛋補白，煌纖維巾蛋白勿原，但凝血也酶原砍和其醉它凝錯血因韻子等闊均由肝細拉胞合成死。2、γ球蛋歇白主至要來固自漿細投胞。免疫噴球蛋錘白大林多數(shù)磁存在脊于丙壞種球葛蛋白識（γ-球蛋椒白）孩中。免疫川球蛋腹白可冒以分壺為Ig氧G、Ig掏A、Ig委M、Ig鑄D、Ig御E五類額。一般pH務7.翅0時，50％硫?qū)W酸銨畢飽和鹿度可士將所裙有的5種Ig（球煌蛋白汗）沉每淀出蝴來。33％飽咳和度債大部謀分Ig喊G可沉期淀出駱來。意義畫：制遇備出球的純側化Ig響G，可單用于葛酶標控抗體胞或熒恩光抗婚體的蠻制備棟。實驗樹器材1．動居物抗掛血清賓：成饑年牛慈血清盯、新允生牛鏟血清2．硫脖酸銨脖飽和藏溶液沫、0.醫(yī)01辱mo草l/朝L的PB洞S3．冰劣箱、詠離心臺機、羞電磁眾攪拌陸器、躍天平緣瑞、尼示龍繩蘭等。實驗饞步驟1.取xm份l血清校（2m返l），加鋼等量0.殿01袍mo主l/枕L的PB頓S稀釋舍，攪背拌下表逐滴遵加入逐飽和(N巴H4)2SO4溶液2X漠m學l（4m尾l），邊堆加邊套攪拌男，4℃靜置30分鐘惑以上蝕，使身其充歷分沉祥淀。2.離心江：30心00～40爭00挪r/嶺mi蕉n離心20猜mi劑n，棄貓上清音。3.以0.劃01悠mo占l/變L的PB槳S溶解遠沉淀煉至Xm鍛l（5m傍l），再逐辰滴加柿入飽密和(N罷H4)2SO4X/兇2m手l（2.躺5m飽l)。置4℃，30～60分鐘蔑。4.再離輛心：30蝦00盲r～40脹00京r/喇mi爐n離心20爸mi疾n，棄醒上清裁。5.重復籌上述蠶第3、4步驟1－2次，璃可得慶到較莫純的Ig輩