Caspase8、3蛋白在PUVA誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡時的變化

Caspase8、3蛋白在PUVA誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡時的變化

【摘要】目的研究Caspase8、3蛋白在補骨脂素加長波紫外線光化學(xué)療法誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞凋亡時的變化。方法用不同濃度的中藥補骨脂中提取的PSO和不同照射時間、波長為360nm的UVA作用于K562細(xì)胞，檢測細(xì)胞凋亡率、在電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變及Caspase8、3蛋白的表達(dá)，用多因素方差分析法對定量資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果PSO、UVA照射及PUVA均可使細(xì)胞凋亡率增加，后兩者上調(diào)Caspase8、3蛋白的表達(dá)，PUVA的作用顯著強于前兩者；PUVA處理后的K562細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。結(jié)論PUVA可通過激活Caspase8、3基因誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】光化學(xué)療法K562細(xì)胞凋亡Caspase8Caspase3

Abstract：ObjectiveTostudythechangesofCaspase8andCaspase3proteinsinK562cellsduringapoptosisinducedbypsoralen(PSO)plusultravioletA(UVA)(PUVA).MethodsTheK562cellsweretreatedwithPSOextractedfromChinesemedicinepsoraleafruitsindifferentconcentrationsplusUVA(360nm)indifferentirradiationtimeornot.Apoptosisratios,ultrastructurechangesandexpressionofCaspase8andCaspase3proteinsweredetected.Thefactorialdesignandanalysisofvariancewereusedtoanalyzetheinteractionamongthefactors.ResultsPSO,UVAandPUVAallincreasedtheapoptosisratiosandUVAandPUVAupregulatedtheexpressionofCaspase8andCaspase3proteins,buttheeffectsofPUVAwerethestrongest.TherewereobviousultrastructurechangesinapoptosisaftertreatmentwithPUVA.ConclusionPUVAcaninducetheapoptosisofK562cellsthroughactivatingCaspase8andCaspase3genes.

Keywords：photochemotherapy;K562cell;apoptosis;Caspase8;Caspase3

化療藥物殺傷白血病細(xì)胞的主要途徑是誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，Caspases(Cysteinylasparatespecificproteinase)是一種特異性蛋白酶，以執(zhí)行細(xì)胞凋亡而受到廣泛關(guān)注［1~2］。Caspase8和Caspase3均屬于該家族的成員，在凋亡過程中發(fā)揮重要作用，其中前者被認(rèn)為是凋亡的啟動者，后者被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者［3］。PUVA是補骨脂素(psoralen，PSO)加長波紫外線光化學(xué)療法，目前的研究對象多為人工合成PSO衍生物，我們從中藥補骨脂中提取了PSO，研究PUVA在誘導(dǎo)人類白血病細(xì)胞K562凋亡時Caspase8、Caspase3蛋白的變化，以進(jìn)一步了解PUVA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用機制。

1材料與方法

細(xì)胞株人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)惠贈。常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

藥品及主要試劑

補骨脂素由大連理工大學(xué)及我院共同由純中藥補骨脂中提取和制備。RPMI1640培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品。小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司產(chǎn)品。HistostainTMPlUsKits免疫細(xì)胞化學(xué)分析試劑盒購自美國Zymed公司。DAB(3，3’diaminobenzidinetetrahydrochloride)顯色試劑盒購自美國VectorLtd公司。Caspase8、Caspase3兔抗人多克隆抗體購自CellScience公司。

儀器和設(shè)備

流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，GLY10型光量子血液平衡治療儀由徐州華衛(wèi)醫(yī)療設(shè)備公司研制。

流式細(xì)胞術(shù)測定

PUVA后24hK562細(xì)胞的凋亡情況取濃度為×105/ml，處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞5ml，分別加入補骨脂素0，5，10，20，40μl，使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0，10，20，40，80mg/L，放入石英比色皿中，在GLY10型光量子血液平衡治療儀上以1J/m2輻射量邊照射邊震蕩，照射時間分別為0min，5min。處理后各實驗組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集×105細(xì)胞，用PBS洗2次，棄上清，加入100μl碘化丙啶染液，避光反應(yīng)30min，加入PBS400μl，上機檢測，并用Multicycle軟件分析得出相應(yīng)的細(xì)胞凋亡百分率。

透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點

收集濃度為×105/ml，經(jīng)PUVA處理的K562細(xì)胞10ml，用PBS清洗2次，轉(zhuǎn)入ml離心管，離心3min，棄上清，緩緩加入%戊二醛2ml，4℃冰箱靜置2h以上。磷酸緩沖液沖洗，鋨酸固定，水洗、脫水，浸透、包埋，制定超薄切片，透射電鏡下觀察。

免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)檢測

Caspase8、Caspase3蛋白的表達(dá)情況細(xì)胞處理方法同前，選擇PSO濃度為40、80mg/L，UVA照射時間5min組，以及PUVA組進(jìn)行ICC檢測。在處理后0、4、8和12h，以移液器吸取經(jīng)處理的細(xì)胞懸液，注入離心管中離心，棄上清，加1×PBS()混勻清洗，再離心，棄上清混勻后均勻涂片，室溫吹干，繼而用100%冷丙酮-20℃固定20min，自然晾干，用于ICC分析。ICC分析方法參照試劑盒說明書，抗體的稀釋倍數(shù)為1：100，PBS代替一抗為陰性對照。

統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗結(jié)果均來自至少3組平行實驗。采用多因素方差分析法對定量資料進(jìn)行統(tǒng)計分析；所有統(tǒng)計計算均用統(tǒng)計軟件進(jìn)行，P＜認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。臨床軍醫(yī)雜志第36卷

2結(jié)果

誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測PUVA后24hK562細(xì)胞凋亡率，見表1。表1PUVA后24hK562細(xì)胞凋亡率

透射電鏡下觀察PUVA后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

K562細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮，胞核體積減小，可裂解成一個或數(shù)個致密體，可見核小體碎裂，核染色質(zhì)聚集或邊集，部分染色質(zhì)致密成斑塊狀或沿核膜收縮成新月體狀，整個細(xì)胞可裂解成大小不一凋亡小體。

對Caspase8、Caspase3蛋白的影響

應(yīng)用ICC法檢測Caspase8、Caspase3蛋白的表達(dá)情況，Caspase8、Caspase3蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)或核上，呈棕黃色顆粒。每張涂片隨機選取3個視野，計數(shù)100個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的百分比，見表2、3，封二圖4。表2PUVA后K562細(xì)胞Caspase8蛋白的表達(dá)表3PUVA后K562細(xì)胞Caspase3蛋白的表達(dá)

3討論

過去的研究已經(jīng)證實PUVA對人類白血病細(xì)胞有殺傷作用［4］，在此基礎(chǔ)上我們通過流式細(xì)胞技術(shù)和電鏡技術(shù)對K562細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行了檢測和分析，進(jìn)一步證實PUVA對人類慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞有明顯誘導(dǎo)凋亡的作用，可以說明誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡是PUVA殺傷人類白血病細(xì)胞K562的途徑之一。在哺乳動物細(xì)胞，Caspase以依賴線粒體和非依賴線粒體兩條途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Caspase8和Caspase3在其中起重要作用。前者是細(xì)胞凋亡的啟動者，被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活［5］，且可將凋亡信號從非依賴線粒體途徑傳遞到線粒體途徑，把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，放大凋亡信號［6］；后者是線粒體—細(xì)胞色素C途徑、死亡配體和受體途徑、顆粒酶B途徑的共同通路［7~9］，是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子。

本組結(jié)果顯示，單純PSO對K562細(xì)胞Caspase8、Caspase3蛋白的影響較小，兩個濃度組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，未見到隨著作用時間的延長而出現(xiàn)的作用增強；UVA及PUVA可使K562細(xì)胞Caspase8、Caspase3蛋白的表達(dá)增強，對前者的作用PUVA要顯著強于UVA，但對后者PUVA與UVA組間沒有看到明顯的差異，PUVA對兩者的作用呈一定的時間依賴性，均在作用8h達(dá)峰。從研究中我們還發(fā)現(xiàn)，PUVA對Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)產(chǎn)生明顯作用的時間分別為作用8h和4h。理論上，前者是凋亡的啟動者，后者是凋亡的執(zhí)行者，對前者產(chǎn)生影響的時間應(yīng)該在后者之前，這樣的結(jié)果或許是因為兩者從基因水平轉(zhuǎn)錄至蛋白水平所需時間的不同所致。綜上所述，我們可以認(rèn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是PUVA殺傷人類白血病細(xì)胞K562的途徑之一；PUVA在誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程中激活了Caspase8、Caspase3，兩者至少需要8h才能在蛋白水平上發(fā)揮最大作用。

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