食品微生物學(xué)第六章詳解演示文稿

食品微生物學(xué)第六章詳解演示文稿本文檔共135頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分優(yōu)選食品微生物學(xué)第六章本文檔共135頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分傳統(tǒng)食品微生物檢測：以分離、純化、培養(yǎng)為基礎(chǔ)現(xiàn)代食品微生物檢測：新理論、新技術(shù)遺傳學(xué)特性、細(xì)胞組分、數(shù)值分類快速、靈敏、特異本文檔共135頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分第一節(jié)食品中微生物數(shù)量的檢測方法檢測食品中微生物總數(shù)的方法：1）活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法（Standardplatecount,SPC）2）最近似數(shù)測定法（mostprobablenumber,MPN）本文檔共135頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分檢測食品中微生物總數(shù)的方法：3）染色還原技術(shù)估算具有還原能力的各種細(xì)胞的總數(shù)4）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（DMC）本文檔共135頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分一、傳統(tǒng)的SPC方法活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法（Standardplatecount,SPC）菌落總數(shù)計(jì)數(shù)法“活菌”標(biāo)準(zhǔn)方法意義：判定食品被微生物污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，也可觀察微生物在食品中生長繁殖的動(dòng)態(tài)。本文檔共135頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分菌落總數(shù)：在一定條件下（需氧、溫度、時(shí)間、pH…)每克（每毫升）食品檢驗(yàn)所生長出來的CFU（菌落形成單位）。本文檔共135頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分國標(biāo)規(guī)定：在需氧條件下：細(xì)菌NA37℃48h霉菌酵母PDA25~28℃5天本文檔共135頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分測定方法

檢測樣品的處理稀釋傾注（涂布）瓊脂平板計(jì)數(shù)報(bào)告本文檔共135頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（一）樣品采集1、采樣原則：代表性防止污染2、采樣的種類：大樣一整批樣品中樣200g小樣分析的樣品（檢樣）25g本文檔共135頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分3、采樣方法：

無菌操作采樣用具必須無菌盡量采集有包裝的食品粉末狀樣品邊取樣邊混合液體樣品邊振搖邊混合冷凍食品保持冷凍狀態(tài)非冷凍食品保存在0~5℃

本文檔共135頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分4、采樣數(shù)量和部位：

200g/件乳制品一瓶（個(gè)、罐、聽）糧三層五點(diǎn)（表、中、下）油重點(diǎn)采取表層及底層油5、采樣標(biāo)簽：名稱來源數(shù)量編號(hào)時(shí)間..（二）送檢從采樣到實(shí)驗(yàn)室越快越好

不得超過3h本文檔共135頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（三）樣品的處理和稀釋1）取樣無菌操作25g放入225mL滅菌生理鹽水的無菌瓶內(nèi)（1：10稀釋液）2）均勻混合均質(zhì)器本文檔共135頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分3）稀釋4）傾注1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml本文檔共135頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分5）傾注平板

稀釋液移入平皿后，將46℃~的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿?？瞻讓?duì)照本文檔共135頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分6）倒置

培養(yǎng)瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板細(xì)菌37℃48h~霉菌28℃5天本文檔共135頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（四）菌落計(jì)數(shù)法

肉眼觀察放大鏡TTC（氯化三苯基四氮唑)顯色（五）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告報(bào)告單位：cfu/g(mL)1、平板菌落數(shù)的選擇：30~3002、稀釋度的選擇：本文檔共135頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（五）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告3、菌落數(shù)的報(bào)告：100以內(nèi)時(shí)按實(shí)數(shù)報(bào)告大于100時(shí)兩位有效數(shù)字1640016000本文檔共135頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分涂布平板法

先倒平板待凝固后，吸取0.1ml稀釋液于平板表面上，用滅菌涂布棒在整個(gè)平板上均勻涂布，培養(yǎng)觀察。本文檔共135頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分涂布法的優(yōu)缺點(diǎn)可檢測到熱敏性菌體菌落形態(tài)比較明顯更適合于嚴(yán)格的好氧菌沒有傾注法簡便，易出現(xiàn)菌落重疊、混雜現(xiàn)象本文檔共135頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分二、旋轉(zhuǎn)接種法（Spiralplatemethod）

1970年FDA原理：接種針將樣品液以螺旋方式從平板中央往外連續(xù)接種。接種量：0.05mL本文檔共135頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分優(yōu)點(diǎn)：可測定50~500000cfu/mL的菌數(shù)樣品不需事先稀釋不需做2個(gè)重復(fù)接種速度快結(jié)果可人工計(jì)數(shù)，也可用激光計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)人力與物力花費(fèi)成本低廉測定結(jié)果與傳統(tǒng)方法相關(guān)性高本文檔共135頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分缺點(diǎn)：設(shè)備投資較高含顆粒樣品容易堵塞管道如果樣品的帶菌量超出范圍則結(jié)果準(zhǔn)確性降低對(duì)瓊脂平板表面要求高本文檔共135頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分菌落計(jì)數(shù)的其它方法膜過濾MPN染色還原計(jì)數(shù)法DMC本文檔共135頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分三、膜過濾SPC方法的改良過濾膜的孔徑0.45um收集菌體提高檢出率直接顯微計(jì)數(shù)膜過濾與熒光染色方法結(jié)合本文檔共135頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分直接熒光膜技術(shù)計(jì)數(shù)法（DEFT）

DirectEpifluorescentFilterTechnique本文檔共135頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分DEFT—微菌落計(jì)數(shù)

僅用于活細(xì)胞的檢測原理：食品勻液經(jīng)DEFT膜過濾，膜放在培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)至微菌落長出，顯微鏡觀察G-3hG+6h本文檔共135頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分快速檢測技術(shù)特殊濾膜（0.5um）過濾樣品液濾膜經(jīng)啶橙染色紫外光顯微鏡觀察活細(xì)胞橙色熒光死細(xì)胞綠色熒光20~30min本文檔共135頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分四、最近似數(shù)測定法（MPN）

選擇3個(gè)稀釋梯度的稀釋液，每種稀釋液接種3管（5管）裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果查MPN檢索表，得到樣品中微生物數(shù)量。本文檔共135頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分

1915年McCrady發(fā)明MPN的優(yōu)點(diǎn)：方法相對(duì)簡單與SPC相比，相似率較高用選擇性培養(yǎng)基可檢測特殊的微生物類群測定大腸菌群數(shù)量的方法本文檔共135頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分

MPN的缺點(diǎn)：需要大量的玻璃器皿（特別是5試管實(shí)驗(yàn)）不能觀察微生物菌落的形態(tài)準(zhǔn)確性不高本文檔共135頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分1、大腸菌群（coliformgroup）

領(lǐng)域用語與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌定義：一群需氧及兼性厭氧，在37℃經(jīng)24h能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

本文檔共135頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分主要包括：大腸埃希氏菌屬（Escherichia）檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）克雷氏菌屬（Klebsiella）產(chǎn)氣腸桿菌屬（Enterobacter）非典型大腸桿菌典型大腸桿菌本文檔共135頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分目前，大腸菌群已被我國和許多國家用作食品質(zhì)量評(píng)價(jià)的指示菌。一般認(rèn)為，大腸菌群都是直接或間接來自人與溫血?jiǎng)游锏募S便。

本文檔共135頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分2、檢測大腸菌群的意義

糞便污染食品的指示菌大腸菌群數(shù)的高低，表明糞便污染的程度和對(duì)人體健康危害性的大小腸道致病菌污染食品的指示菌

大腸菌群數(shù)的高低，表明腸道致病菌存在的可能性大?。ú⒎且欢ㄆ叫校。?/p>

本文檔共135頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分3、大腸菌群檢測方法與檢驗(yàn)結(jié)果

檢驗(yàn)結(jié)果：用每100mL（g）樣品中大腸菌群最近似數(shù)來表示，簡稱大腸菌群MPN.檢測方法：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)、證實(shí)試驗(yàn)見GB4789.3-1994本文檔共135頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分五、染色還原計(jì)數(shù)法一種估計(jì)活性微生物數(shù)量的方法。原理：活細(xì)胞內(nèi)含有還原酶，可把特定的染料從一種顏色還原為另外一種顏色。本文檔共135頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分亞甲基藍(lán)（蘭色）白色刃天青（暗蘭色）粉紅色或白色染色還原的時(shí)間與樣品中微生物濃度成反比兩種染料：本文檔共135頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分應(yīng)用：乳品工業(yè)上原料乳中的微生物檢測優(yōu)點(diǎn)：簡便、快捷和經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：不同的微生物還原能力不同，給估算帶來了一定的困難。不適用于含有還原酶的食品應(yīng)用及優(yōu)、缺點(diǎn)本文檔共135頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分六、顯微直接計(jì)數(shù)法

（Directmicroscopecount,DMC）一定量的食品（0.001mL）顯微鏡載玻片（1cm2）烘干、固定、脫脂、染色復(fù)式顯微鏡計(jì)數(shù)換算本文檔共135頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分DMC方法的優(yōu)點(diǎn)快捷、簡便能對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析載玻片易保存，作參考可使用熒光技術(shù)增強(qiáng)效果本文檔共135頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分DMC方法的缺點(diǎn)僅適于檢含大量菌體的樣品準(zhǔn)確性差易造成操作人員的疲勞本文檔共135頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分七、棉拭子涂抹法

表層微生物的檢測應(yīng)用于食品、公共場所本文檔共135頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分方法：1）無菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水（10mL試管）均勻涂抹樣品表面一定面積（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回試管中，及時(shí)送檢；本文檔共135頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分2）試管振蕩，使微生物懸浮于稀釋液中；3）按SPC方法進(jìn)行梯度稀釋、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

此外，紙片法……本文檔共135頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分第二節(jié)物理、化學(xué)、分子和免疫方法本文檔共135頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分一、物理方法阻抗測定法微量量熱法本文檔共135頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（一）阻抗測定法（impedance）

1899年G.N,Stewart估算20世紀(jì)70年代應(yīng)用阻抗：交流電路中導(dǎo)電物質(zhì)對(duì)電流所起的阻礙和抵抗作用，可由電導(dǎo)和電容計(jì)算。本文檔共135頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分原理：微生物可使培養(yǎng)基中電惰性底物，如碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)代謝成為電活性產(chǎn)物（乳酸鹽或氨等）當(dāng)微生物生長繁殖時(shí)，培養(yǎng)基中的電惰性分子即為許多電活性分子所取代，從而使培養(yǎng)基的電導(dǎo)性增大，培養(yǎng)基的阻抗降低。本文檔共135頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分檢測時(shí)間（detectiontime)樣品接種后從開始培養(yǎng)到阻抗值發(fā)生急劇變化的時(shí)間。與原始菌數(shù)成反比Bactomer細(xì)菌計(jì)數(shù)器準(zhǔn)確率93%10~100個(gè)5h~本文檔共135頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（二）微量量熱法（Microcalorimetry）細(xì)菌生長時(shí)產(chǎn)生熱量測定微小溫度變化的儀器—量熱計(jì)批次型：早期應(yīng)用流動(dòng)型：靈敏、快速本文檔共135頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分二、化學(xué)方法（一）熱穩(wěn)定性核酸酶（DNAse）

S.aureusG（+）凝固酶（+）產(chǎn)腸毒素菌株95%產(chǎn)熱穩(wěn)定性核酸酶耐高溫本文檔共135頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分原理：檢測食品中熱穩(wěn)定性核酸酶的含量，可以精確計(jì)算出金黃色葡萄球菌的數(shù)量。本文檔共135頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分

分光光度法

熱穩(wěn)定性核酸酶是S.aureus生長的標(biāo)志凝固酵素是產(chǎn)腸毒素菌株的標(biāo)志本文檔共135頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（二）ATP的測定生命體的主要能源細(xì)胞中ATP含量恒定ATP測定計(jì)數(shù)法的原理根據(jù)ATP可與從熒火蟲中提取的熒光素酶作用發(fā)光，發(fā)光的總光量與ATP的量成正比。本文檔共135頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分

光強(qiáng)度推算出細(xì)菌細(xì)胞數(shù)液體發(fā)光分光計(jì)照度計(jì)結(jié)果與SPC法一致10~25min本文檔共135頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分ATP檢測法的應(yīng)用：

檢測微生物數(shù)量的快速方法醫(yī)學(xué)：尿樣的檢驗(yàn)環(huán)境衛(wèi)生：表面微生物的測定本文檔共135頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（三）輻射測量法（Radiometric）原理

利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時(shí)產(chǎn)生CO2的原理，把微量元素標(biāo)記到葡萄糖或其他糖類分子中。放射能計(jì)數(shù)器本文檔共135頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分放射物的種類C-14葡萄糖C-14甲酸鹽C14-谷氨酸鹽放射量與菌數(shù)成正比檢測C-14所需的時(shí)間與食品中微生物的含量成反比。本文檔共135頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分應(yīng)用醫(yī)學(xué)：“吹口氣，查胃病”30min食品：微生物含量高5~6h微生物含量低更廠本文檔共135頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分三、食品微生物的指紋識(shí)別和鑒定

“指紋”概念由于每種微生物的化學(xué)組分（DNA、蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)、性能有差別及其特異性代謝產(chǎn)物等通過分析技術(shù)出現(xiàn)的特征性的圖譜本文檔共135頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（一）血清學(xué)方法特殊的抗體鑒定同源抗原G-菌體（O）抗原鞭毛（H）抗原熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性差本文檔共135頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分抗原（Antigen，Ag）Antigensaremacromoleculesthatelicitanimmuneresponseinthebody.Antigenscanbeproteins

polysaccharides

conjugatesoflipidswithproteins(lipoproteins)andpolysaccharides(glycolipids).本文檔共135頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Antibodiesareimmunesystem-relatedproteinscalledimmunoglobulins（Ig）.Eachantibodyconsistsoffourpolypeptides–twoheavychainsandtwolightchainsjoinedtoforma"Y"shapedmolecule.抗體（Antibody，Ab）本文檔共135頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Structureofantibody本文檔共135頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（二）噬菌體（phage）類型原理：根據(jù)噬菌體和它的宿主細(xì)菌之間的特殊關(guān)系，用已知的噬菌體鑒定其特定的宿主細(xì)菌。本文檔共135頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（三）分子生物學(xué)方法基因探針技術(shù)DNA擴(kuò)增法限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)脈沖場凝膠電泳本文檔共135頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分1.基因探針技術(shù)探針（Probe）：經(jīng)過標(biāo)記的一段短核苷酸，用于檢測與之同源的核苷酸序列。Probeisashortlabellednucleotideusedtodetecthomologousnucleotidesequence.本文檔共135頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Lengthofprobe：

20-1000bpTypeofprobe：

Oligonucleotideprobes（20-40bp）SinglestrandedDNAprobes（200-500bp）DoublestrandedDNAprobes

RNAprobesorRiboprobes本文檔共135頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分

Radioactive：32P、35S、3H、14CDigoxigenin（Dig）BiotinFluorescentdyeChoiceofLabelling：

Non-radioactive：本文檔共135頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分UnknownDNA本文檔共135頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Colony

hybridization本文檔共135頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分可檢測的細(xì)胞數(shù)量：106-107

必須進(jìn)行細(xì)胞富集！

探針檢測的靈敏度與檢測時(shí)間細(xì)胞數(shù)量為108，檢測需要10-12h本文檔共135頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分2.DNA擴(kuò)增法（1）多聚酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction，PCR1985年，美國PE-Cetus公司人類遺傳學(xué)研究室的KaryMullis發(fā)明1993年，Mullis獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)本文檔共135頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分PCR的基本原理DNA的結(jié)構(gòu)DNAdoublehelix本文檔共135頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分DNA的復(fù)制DNAsemi-conservedreplication本文檔共135頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分本文檔共135頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分本文檔共135頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分三步曲：變性（Denaturation）退火（Annealling）延伸（Extension）一個(gè)循環(huán)（cycle）一般進(jìn)行25-30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)的三步曲與五要素本文檔共135頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Step1：雙鏈DNA熱變性（94℃）；Step2：引物與模板單鏈DNA退火（55℃）；Step3：DNA的聚合延伸反應(yīng)（72℃）；Step4：擴(kuò)增的雙鏈DNA再次熱變性（返回Step1）。本文檔共135頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分五要素：●模板DNA（template）●引物（Primer）●DNA聚合酶（Polymerase）●緩沖液（Buffer，Mg++）●脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）本文檔共135頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分本文檔共135頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的量實(shí)際：Nf=N0（1+Y）N其中Y為擴(kuò)增效率理論：Nf=N0X2N

其中N為循環(huán)次數(shù)，N0為起始拷貝數(shù)，Nf為最終拷貝數(shù)本文檔共135頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳本文檔共135頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Denaturing94oCTemperature100055Time5’3’3’5’本文檔共135頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分PCRDenaturing94oCTemperature100055Time3’5’5’3’Heat本文檔共135頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Denaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time3’5’5’3’5’5’Denaturing94oC本文檔共135頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Denaturing94oCDenaturingng94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’HeatHeat5’5’5’本文檔共135頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Denaturing94oCDenaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’本文檔共135頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分PCRProductsWithEachThermalCycle0CyclesNumber1382412416532664本文檔共135頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（2）隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA

RandomAmplifiedPolymorphicDNA

（RAPD）DevelopedbyWilliamsetal.(1990)using10baseprimerstogeneraterandomfragmentsfromtemplateDNAsRAPDfragmentscanbeseparatedandusedasgeneticmarkersorakindofDNAfingerprint本文檔共135頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Tworelatedtechniques:

1.ArbitraryPrimedPCR(AP-PCR)WelshandMcClelland(1990)longerprimers(18-25bases)2.DNAAmplificationFingerprinting(DAF)Caetano-Anollesetal.(1991)veryshortprimers(8bases)本文檔共135頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分ComponentsofPCRandRAPDRAPD1.Buffer(Mg++)–usuallyhighMg++concentration2.TemplateDNA1shortprimer(10bases)annealstoanyspecificpartofthetemplateDNA4.dNTPs5.TaqPCR1.Buffer(Mg++)2.TemplateDNA2PrimersthatflankthefragmentofDNAtobeamplifieddNTPs5.Taq本文檔共135頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分TwomodificationsmadetotypicalthermalcyclingwhenRAPDisbeingdone:Annealingtemperaturesaregenerallyverylow,around36°C-ThisallowsveryshortprimerstoannealtotemplateDNAMorethermalcyclesareused,typically45-Thiscompensatesfortheinefficiencywhichresultsfromusingsuchshortprimers.本文檔共135頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分TemplateDNAPrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplaceRAPD本文檔共135頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分TemplateDNAPrimerspointawayfromeachother,soamplificationwon’thappenRAPD本文檔共135頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分TemplateDNAPrimerspointinthesamedirection,soamplificationwon’thappenRAPD本文檔共135頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分TemplateDNAPrimerstoofarapart,soamplificationwon’thappen>2,000basesRAPD本文檔共135頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分TemplateDNAPrimersarejusttherightdistanceapart,sofragmentisamplified100-1,500basesRAPD本文檔共135頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分MM2345678910RAPD產(chǎn)物的電泳圖譜本文檔共135頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分PCRMachine本文檔共135頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分3.限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）RestrictionFragmentLengthPolymorphism（1）限制性內(nèi)切酶

(Restrictionendonuclease）保護(hù)細(xì)菌不受外來DNA侵入來自細(xì)菌的一種內(nèi)切酶本文檔共135頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：識(shí)別4-8bp特定序列(sitespecific)兩股DNA上各產(chǎn)生一個(gè)切口回文序列(palindromesequence)5’-GTTACATGAGATCACGGATTC-3’3’-CAATGTACTCTAGTGCCTAAG-5’本文檔共135頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分產(chǎn)生粘性末端(cohesiveend,stickyend)5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAEcoRI5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCMspIAATTCACGGATTC-3’GTGCCTAAG-5’CGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAAATTCACGGATTC–3’GTGCCTAAG-5’5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCCGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’本文檔共135頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAHpaI5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCHaeIIIAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’CCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’產(chǎn)生平末端(bluntend)5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCCCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’本文檔共135頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（2）限制性圖譜

(Restrictionmap）本文檔共135頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（3）限制性片段長度多態(tài)性

(RFLP）本文檔共135頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分本文檔共135頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分4.脈沖場凝膠電泳技術(shù)PulsedFieldGelElectrophoresis（PFGE）本文檔共135頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分本文檔共135頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分四、免疫學(xué)方法精確性(Accurate)靈敏性(Sensitive)特異性(Specific)本文檔共135頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（一）熒光抗體法（FA）（Fluorescenceantibody）1942年創(chuàng)立，在食品和醫(yī)學(xué)微生物中應(yīng)用廣泛。原理：抗體與熒光物質(zhì)結(jié)合而帶有熒光，與相應(yīng)抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可以觀察，也可計(jì)數(shù)。本文檔共135頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）若丹名B（RhodamineB）本文檔共135頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（二）沙門氏菌1-2實(shí)驗(yàn)（1-2Test）原理：血清學(xué)原理,即抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的免疫帶。一種檢測有動(dòng)力的沙門氏菌的方法本文檔共135頁；當(dāng)前第114頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分在一個(gè)特殊的含兩個(gè)容器的塑料設(shè)備中進(jìn)行：一個(gè)容器中裝有選擇性液體培養(yǎng)基，另一個(gè)中裝有非選擇性運(yùn)動(dòng)性培養(yǎng)基（半固體），并含有鞭毛抗體。恒溫培養(yǎng)時(shí)，運(yùn)動(dòng)性沙門氏菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)后進(jìn)入非選擇性培養(yǎng)基，并與其中的抗體結(jié)合形成免疫帶。本文檔共135頁；當(dāng)前第115頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分Inoculationchamber本文檔共135頁；當(dāng)前第116頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分優(yōu)點(diǎn)：將血清學(xué)反應(yīng)和生化增菌過程結(jié)合起來，特異性強(qiáng)；不需特殊實(shí)驗(yàn)室條件，簡便；8-14小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，快速。缺點(diǎn)：不能檢測非運(yùn)動(dòng)型沙門氏菌，免疫條帶的判斷有主觀因素。本文檔共135頁；當(dāng)前第117頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分（三）酶聯(lián)免疫吸附劑測定

EnzymeLinkedImmunosorbentAssay1971年Engvall和Perlmann（ELISA）canmeasureantibodiesorantigensinexpensive,rapid,quantitative,specificsensitive(pg/ml)expensiveequipmentnotrequiredcanbeautomated本文檔共135頁；當(dāng)前第118頁；編輯于星期二\7點(diǎn)59分ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。原理：本文檔共135頁；當(dāng)前第