微生物學(xué)基本操作技術(shù)演示文稿

微生物學(xué)基本操作技術(shù)演示文稿本文檔共97頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分內(nèi)容微生物分類微生物接種和培養(yǎng)微生物的分離微生物的鑒定微生物保藏質(zhì)控微生物本文檔共97頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分一、微生物分類本文檔共97頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分一、微生物分類-微生物的進(jìn)化和多樣性普遍性系統(tǒng)發(fā)育樹,親緣關(guān)系根據(jù)rRNA序列比較來決定。G.J.OlsenandC.R.Woese,‘RibosomalRNA:AkeytoPhylogeny’intheFASEBJournal,7:113-123,1993本文檔共97頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分一、微生物分類原核生物大小:0.5-3mm形狀:-球型(Sthaphylococcus)-棒狀(Escherichiacoli)-螺旋(Rhodospirillum)生長(zhǎng)迅速，20min至幾小時(shí)可繁殖一代可利用多種碳源

真核生物細(xì)胞器：線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體液泡本文檔共97頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分一、微生物分類procaryote.jpg本文檔共97頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分原核生物一、微生物分類本文檔共97頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分真核生物一、微生物分類本文檔共97頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分一、微生物分類-多相分類表征（表型）特征形態(tài)特征生理和代謝特征生態(tài)特征遺傳（基因型）特征蛋白質(zhì)比較核酸堿基組成核酸序列多相分類PolyphasicTexonomyTechnology本文檔共97頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分一、微生物分類-微生物的分類等級(jí)“種”是微生物分類中最基本的分類單元?！胺N”的定義：一個(gè)種（基因型種）是有相似G+C組成并通過DNA雜交試驗(yàn)判斷由70%或更大相似性的菌株的集合。分類等級(jí)界（Domain）門（Phylum）綱（Class）目（Order）科（Family）屬（Genus）種（Species）本文檔共97頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)本文檔共97頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)微生物接種定義將微生物的純種或含菌材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，這個(gè)操作過程叫微生物的接種。接種工具

微生物接種技術(shù)分類斜面接種液體接種穿刺接種平板接種

本文檔共97頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)斜面接種左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平；右手先將棉塞（硅膠塞）擰轉(zhuǎn)松動(dòng)，再拿接種環(huán)；用右手的小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時(shí)將管口在火焰上灼燒；接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內(nèi)，冷卻、挑菌，轉(zhuǎn)入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。本文檔共97頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)本文檔共97頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)液體接種操作方法與斜面接種基本一致，只是將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時(shí)使接種環(huán)與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散；塞上棉塞，輕輕搖動(dòng)均勻；如果菌種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，使用移液管或滴管接種。本文檔共97頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)本文檔共97頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分三、微生物接種和培養(yǎng)穿刺接種用接種針調(diào)取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)（不要刺到底部），再沿原路拔出；此法用于厭氣性細(xì)菌接種，檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。本文檔共97頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)本文檔共97頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)平板接種平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計(jì)數(shù)等；平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面；斜面接平板：點(diǎn)種法、劃線法。本文檔共97頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分二、微生物接種和培養(yǎng)本文檔共97頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分三、微生物分離本文檔共97頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分微生物純培養(yǎng)分離技術(shù)純培養(yǎng)物是指來源于同一單細(xì)胞的細(xì)胞群體。獲得純培養(yǎng)物對(duì)微生物學(xué)研究至關(guān)重要。本文檔共97頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分微生物純培養(yǎng)分離技術(shù)涂布平板法平板劃線法平板傾注法稀釋搖管法液體培養(yǎng)基分離法單細(xì)胞（孢子）分離法選擇培養(yǎng)基分離法本文檔共97頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分涂布平板法1、少量樣品加到平板中央（0.1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻；4、無菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培養(yǎng)基表面，適當(dāng)條件下培養(yǎng)。本文檔共97頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分涂布平板法樣品需適當(dāng)稀釋30-300CFU/mL本文檔共97頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分平板劃線法斜線法曲線法方格法放射法四格法本文檔共97頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分平板劃線法斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。本文檔共97頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分平板劃線法血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）本文檔共97頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分平板傾注法對(duì)起始樣品進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數(shù)的樣品與冷卻至適當(dāng)溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈豆?fàn)罨蛲哥R狀。本文檔共97頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分稀釋搖管法適合厭氧菌的純培養(yǎng)分離無菌瓊脂培養(yǎng)基試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右梯度稀釋后的待分離菌株加入試管中搖勻、冷凝在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間本文檔共97頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分液體培養(yǎng)基分離不能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。本文檔共97頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分單細(xì)胞（孢子）分離單細(xì)胞（或單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體。個(gè)體相對(duì)較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求。本文檔共97頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分選擇培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基特性促生長(zhǎng)能力抑制能力指示（鑒別）能力本文檔共97頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分選擇培養(yǎng)基分離傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基血平板：適于各類細(xì)菌的生長(zhǎng)，一般細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本的分離，都應(yīng)接種此平板。營(yíng)養(yǎng)肉湯：用于標(biāo)本及各類細(xì)菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，適于接種疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標(biāo)本。中國(guó)藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板：可抑制G+細(xì)菌，有選擇地促進(jìn)G-菌生長(zhǎng)，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。麥康凱平板：具中等強(qiáng)度選擇性，抑菌力略強(qiáng)，有較少革蘭陰性菌不生長(zhǎng)。SS瓊脂：有較強(qiáng)的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌的分離。堿性瓊脂：用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。本文檔共97頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分選擇培養(yǎng)基分離新型顯色培養(yǎng)基利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色的原理來檢測(cè)微生物的培養(yǎng)基。OrganismEnzymeSubstrateColorColiformsβ-galactosidaseX-GALBlueEscherichiacoliβ-galactosidase

β-Glucuronidase

MUGfluorescenceEscherichiacoliO157β-galactosidaseX-GALBlue本文檔共97頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分選擇培養(yǎng)基分離本文檔共97頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分基于酶與底物反應(yīng)的顯色培養(yǎng)基技術(shù)CHROMagar本文檔共97頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分Petrifilm3MAerobicCountPlateColiformCountPlateRapidColiformCountPlateE.coli/ColiformCountPlateEnterbacteriaceaeCountPlateYeastandMoldCountPlateStaph.aureusExpressCountPlateEnvironmentalListeriaPlate基于酶與底物反應(yīng)的顯色培養(yǎng)基技術(shù)本文檔共97頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定本文檔共97頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定多相鑒定（分類)（polyphasictaxonomy）是利用微生物從分子特性到生態(tài)特征的多種不同信息，綜合表型和基因型特征進(jìn)行微生物分類鑒定的方法。本文檔共97頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-形態(tài)學(xué)觀察細(xì)菌酵母絲狀真菌宏觀形態(tài)（培養(yǎng)特征）將培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布，30℃培養(yǎng)16~24小時(shí)，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質(zhì)地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等。將培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，菌落質(zhì)地、菌落顏色、菌落表面是否為反光或暗淡、菌落是平伏還是隆起、菌落邊緣等。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（CA、CYA、WA）平板倒轉(zhuǎn)，向上接種三點(diǎn)，每個(gè)菌株接種兩個(gè)平板，倒置于

25℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)7天。觀察菌落直徑、顏色、質(zhì)地、滲出液、菌落反面顏色等特征。微觀形態(tài)（細(xì)胞特征）將培養(yǎng)物在30℃條件下培養(yǎng)16~24小時(shí)，挑取對(duì)數(shù)期的單菌落，涂布于事先滴加少量無菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進(jìn)行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小等細(xì)胞特征。培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和無性繁殖方式等。用無菌接種針挑取少量培養(yǎng)物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團(tuán)分散開，蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、?；⑵抗！a(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子頭、分生孢子等。本文檔共97頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-形態(tài)學(xué)觀察本文檔共97頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-生理生化碳源和氮源運(yùn)動(dòng)性細(xì)胞壁組成滲透耐性能源氧關(guān)系發(fā)酵產(chǎn)物最適pH和生長(zhǎng)范圍一般營(yíng)養(yǎng)類型光合作用色素最適生長(zhǎng)溫度和范圍鹽需求及耐性發(fā)光次級(jí)代謝產(chǎn)物形成能量轉(zhuǎn)換機(jī)制對(duì)代謝抑制劑和抗生素的敏感性貯藏內(nèi)含物本文檔共97頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-生理生化Divisionbasedonmembranecomposition:a)gram-negative–haveouterandinnermembranesand athincellwall(Escherichiacoli)b)gram-positive–havenooutermembrane,buthavea thickercellwall(Bacillussubtilis)c)neithergram-norgram+-nocellwalls(mycoplasm):85/fox/gram-st.jpg:85/fox/bact-mem.jpg本文檔共97頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-生理生化API(bioMerieux)(biochemical)本文檔共97頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-生理生化BBLCrystal(BectonDickinson)將傳統(tǒng)的生化反應(yīng)、酶—底物呈色反應(yīng)與熒光增強(qiáng)顯色技術(shù)結(jié)合，設(shè)計(jì)鑒定反應(yīng)最佳組合。六類鑒定試驗(yàn)板，可鑒定500種細(xì)菌本文檔共97頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-化學(xué)成分分析本文檔共97頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-基因型分析G+Cmol%16SrDNA,26SrDNAD1/D2,5.8SrDNAITSregion,β-tubulingene,calmodulingene,gyrAgene,pheSgene,recNgene,rpoBgeneandotherhousekeepinggenes.DNABarcodinggenesequenceanalysis,MultiLocusSequenceAnalysis(MLSA)DNA-DNA

hybridizationRAPD,RFLP,AFLP,SSCP,Eric-PCR,BOX-PCR,Rep-PCR,LAMP.本文檔共97頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-基因型分析DNA指紋圖譜分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCPERIC－PCR以細(xì)菌DNA中串聯(lián)重復(fù)序列為引物，通過擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，在不同種屬個(gè)體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，以電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，應(yīng)用于菌株分型。BOX-PCR根據(jù)BOX插入因子(大小為154bp,由保守性不同的boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)等亞單位組成)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增微生物基因組DNA的重復(fù)性片段,最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性。REP-PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù)DNA片段來獲得菌株特異性遺傳圖譜,其中重復(fù)DNA片段包含了一個(gè)高度保守的回文序列(REP)為38bp的片段,由1個(gè)保守回文段以及兩端分別有6個(gè)降解位點(diǎn)和1個(gè)5bp的可變框構(gòu)成。PCR-SSCP是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合，利用不同構(gòu)象單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動(dòng)速率的差異,檢測(cè)出DNA短片段中存在的單核苷酸突變,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種基因多態(tài)性的研究。。假絲酵母PCR-SSCP副溶血弧菌ERIC－PCR沙門氏菌REP-PCR本文檔共97頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例116SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹本文檔共97頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新種發(fā)表2008年ATCC16404鑒定為

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP將ATCC16404更名

2010年WDCM將ATCC16404更名

圖：ATCC16888和ATCC16404的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)a′nosVarga,Sa′ndorKocsube′,Bea′taTo′th,etal.Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistribution.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932圖:Rep-PCR條碼系統(tǒng)發(fā)育樹(DiversiLab平臺(tái))Figure2:DendrogramofRep-PCRBarcoding(DiversiLabPlatform).注：圖片來源于ReclassificationofATCC?16404TMandATCC?9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14表

ITS序列特殊位點(diǎn)堿基差異TableDifferenceofbasepositioninITSsequence四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新種發(fā)表2008年ATCC16404鑒定為

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP將ATCC16404更名

2010年WDCM將ATCC16404更名

圖:基于曲霉黑色組β-微管蛋白基因序列的N-J樹Figure:Neighbour–joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri..注：圖片來源于Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistributionInternational.JournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932圖1:基于ITSDNA序列的黑色曲霉N-J樹Figure1:ANeighborJoiningTreeofBlackAspergillibasedonTheirITSDNASequences.注：圖片來源于ReclassificationofATCC?16404TMandATCC?9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分各種標(biāo)準(zhǔn)中仍將繼續(xù)采用ATCC16404作為質(zhì)控菌株。各類標(biāo)準(zhǔn)中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F)98003)

,需要重新復(fù)核鑒定。黑曲霉？四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分形態(tài)學(xué)鑒定CYA培養(yǎng)基,25°C培養(yǎng)7dBiolog鑒定生長(zhǎng)濁度試驗(yàn)ITSrDNA區(qū)序列分析ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3β-微管蛋白基因序列分析Bt2a:5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3Bt2b:5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3反應(yīng)體系：100μL,10×擴(kuò)增緩沖液10μL;DNA模板1μL;dNTP(每種2.5mmol/L)8μL;引物(10μL/L)各2.5μL;TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)1.3μL;無菌超純水補(bǔ)足總體積100μL。反應(yīng)程序：94°C5min;94°C1min,55°C1min,72°C1min,30個(gè)循環(huán);72°C10min,4°C保存。四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分形態(tài)學(xué)鑒定圖

25°C培養(yǎng)7d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài)FigMacromorphologyandmicromorphologyon25°C,7d注:A菌落形態(tài);B:分生孢子梗形態(tài)(×100);C:分生孢子形態(tài)(×400).Note:A:Colonymorphology,B:Conidiophoremorphology(×100);C:Conidialmorphology(×400).該菌株的形態(tài)學(xué)特征符合黑曲霉A.niger的形態(tài)特征四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分Biolog鑒定注:?:沒有生長(zhǎng);+:生長(zhǎng)旺盛;w:微弱(邊界)生長(zhǎng);v:可變.Note:?:Nogrowth;+:Stronggrowth;w:Weakgrowth;v:Variedgrowth.表

碳源利用情況TableCarbonSourceUtilization碳源CarbonsourceATCC16888AspergillusnigerATCC16404AspergillusbrasiliensisCMCC(F)98003麥芽糖Maltose+?+β-甲基-D-葡萄糖苷β-Methyl-D-Glucoside+?+D-海藻糖D-Trehalose+?+L-蘋果酸L-MalicAcidv+?α-酮戊二酸α-Ketoglutaricacid?w?苦杏仁苷Amygdalin+?+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分ITSrDNA區(qū)序列分析圖

CMCC(F)98003的ITSrDNA區(qū)序列和β-微管蛋白基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果FigITSrDNAandβ-tubulingenePCRamplificationresultsofCMCC(F)98003注:M:DL2000marker;1:ITSrDNA區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果;2:β-微管蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果.Note:M:DL2000marker;1:ITSrDNAPCRamplificationresult;2:β-tubulingenePCRamplificationresult.表

ITS序列特殊位點(diǎn)堿基差異TableDifferenceofbasepositioninITSsequence堿基位點(diǎn)Baseposition140166172173AspergillusbrasiliensisIMI381727CCTCAspergillusnigerATCC16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個(gè)“C”為1位點(diǎn).Note:ThefirstCinthebordersequence(TTACCG)of18SandITS1isheredefinedasposition1.四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分ITSrDNA區(qū)序列分析以18S和ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個(gè)“C”為1位點(diǎn)。140166172、173四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分ITSrDNA區(qū)序列分析圖

基于ITS區(qū)rDNA序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹FigANeighborJoiningTreeofAspergillussectionNigri.basedonTheirITSDNASequences注:圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值,圖例為遺傳距離.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003與與A.nigerATCC16888聚類在分類距離最近的一個(gè)分支上,序列相似性達(dá)100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性也具有很高的相似性,序列同源性均在98.6%?100%之間。四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分β-微管蛋白基因序列分析圖

基于β-微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹FigNeighbour-joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri注:圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值,圖例為遺傳距離.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003與黑曲霉A.nigerCBS554.65T序列同源性為100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性均在94.7%以下。結(jié)合形態(tài)學(xué)、碳源利用情況和ITSrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結(jié)果,將CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉（Aspergillusniger

）。四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2本文檔共97頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分五、微生物保藏本文檔共97頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分菌種是進(jìn)行微生物學(xué)研究和應(yīng)用的基本材料，是發(fā)展生物工程的重要基礎(chǔ)條件之一，是國(guó)家的重要生物資源。菌種保藏管理要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。并對(duì)其所負(fù)責(zé)保藏的菌種均應(yīng)采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌種的污染或死亡。

《中國(guó)微生物菌種保藏管理?xiàng)l例》五、微生物保藏本文檔共97頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分制訂專門菌種保藏管理制度；同一株菌種采用兩種以上保藏方法保存；對(duì)只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個(gè)以上的保藏設(shè)備中；對(duì)菌種的入庫(kù)和出庫(kù)記錄入檔，實(shí)行雙人負(fù)責(zé)制管理；設(shè)專人負(fù)責(zé)管理菌種保藏設(shè)施正常運(yùn)行，定期檢修維護(hù)。五、微生物保藏本文檔共97頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分微生物菌種保藏方法基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境，使其長(zhǎng)期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性?；敬胧┦堑蜏亍⒄婵?、干燥。五、微生物保藏本文檔共97頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分常用菌種保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍干燥法-80℃低溫凍結(jié)法液氮超低溫凍結(jié)法本文檔共97頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分定期移植法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間（3-6個(gè)月）進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：斜面制備接種培養(yǎng)保藏本文檔共97頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分

斜面制備培養(yǎng)基配制分裝滅菌擺放斜面本文檔共97頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分

接種本文檔共97頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分培養(yǎng)細(xì)菌37℃，1-2d酵母28~30℃，2~3d絲狀真菌26℃，5~7d保藏4~6℃保藏3~6個(gè)月

培養(yǎng)和保藏本文檔共97頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分定期移植法操作簡(jiǎn)單，使用方便；對(duì)設(shè)備和人員要求不高；可隨時(shí)使用，便于觀察菌種；工作勞動(dòng)強(qiáng)度大，屬短期保藏，保藏成本高；菌種傳代頻繁，易退化、污染。本文檔共97頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分液體石蠟法指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。本文檔共97頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分

操作步驟：液體石蠟預(yù)處理斜面培養(yǎng)物制備灌注石蠟保藏優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟滅菌：

—121℃濕熱滅菌30min，蒸發(fā)水分；

—160℃干熱滅菌2h；冷卻至室溫。液面高出斜面頂部1cm4～6℃，干燥處；直立放置；保藏時(shí)間1～2年。本文檔共97頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分液體石蠟法操作簡(jiǎn)單，使用比較方便；對(duì)設(shè)備要求不高，對(duì)人員操作水平有一定要求；·菌種易退化、污染。本文檔共97頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分真空冷凍干燥法指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長(zhǎng)期菌種保存方法。本文檔共97頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分安瓿管的準(zhǔn)備清洗選用中性玻璃材質(zhì)的安瓿管；2%鹽酸浸泡8～10h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；標(biāo)簽激光打印標(biāo)簽，標(biāo)明菌株編號(hào)和保藏日期，大小約10×20mm。噴碼于安瓿管外，160℃固定20min。滅菌

121℃，30min.本文檔共97頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分保護(hù)劑的準(zhǔn)備保護(hù)劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，2～5ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113℃滅菌20min；打開放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30℃培養(yǎng)2天，無菌檢查合格后備用。

本文檔共97頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分凍干樣品制備制備斜面培養(yǎng)物；將保護(hù)劑用無菌吸管注入到斜面培養(yǎng)物上，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在保護(hù)劑內(nèi)。用長(zhǎng)毛細(xì)滴管將菌懸液分裝到安瓿管內(nèi)，0.1～0.2ml/管，操作時(shí)要把帶有菌懸液的長(zhǎng)毛細(xì)滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。本文檔共97頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分真空干燥

在開動(dòng)真空泵后應(yīng)使真空度在15min內(nèi)達(dá)到66.5Pa，隨后逐漸達(dá)到26.6～13.3Pa，在此條件下，樣品將保持凍結(jié)狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進(jìn)行。終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時(shí)的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用1～2支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，當(dāng)其水分完全蒸發(fā)時(shí)視為干燥完結(jié)本文檔共97頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分預(yù)凍制備菌懸液、經(jīng)分裝到進(jìn)行預(yù)凍之間的時(shí)間不宜超過1h；分裝完成后將安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱預(yù)凍1h，使菌液完全凍結(jié)；可采用分段式預(yù)凍，先將分裝好的安瓿管置－20℃凍30分鐘，再放入－80℃冰箱凍30min；采用離心式凍干裝置時(shí)勿需預(yù)凍。本文檔共97頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分熔封

將安瓿管的中上部用火焰燒軟，拉成細(xì)頸；將安瓿管裝到多歧管上，用火焰在細(xì)頸處熔封；拉管時(shí)注意火焰不要離菌體太近。本文檔共97頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分真空度檢測(cè)

用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍(lán)光，說明真空度符合要求。

本文檔共97頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分保藏

4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。

本文檔共97頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分真空冷凍干燥法保藏、運(yùn)輸方便；保藏時(shí)間長(zhǎng)(5～10年)；對(duì)設(shè)備要求高(真空冷凍干燥機(jī)、多歧管)，對(duì)人員操作水平要求高；冷凍干燥過程對(duì)菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。本文檔共97頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分-80℃冰箱凍結(jié)法將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)保存的一種長(zhǎng)期菌種保藏方法。準(zhǔn)備冷凍管準(zhǔn)備保護(hù)劑（10%-15%甘油）準(zhǔn)備菌懸液（細(xì)胞、孢子或芽孢懸液）制備冷凍管（取菌懸液和保護(hù)劑至冷凍管）保藏（-80℃，2～5年）本文檔共97頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分Microbank本文檔共97頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分-80℃冰箱凍結(jié)法使用方便；保藏時(shí)間較長(zhǎng)；對(duì)設(shè)備要求高(-80℃冰箱)；運(yùn)輸不方便。本文檔共97頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分液氮超低溫凍結(jié)法指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長(zhǎng)期菌種保藏方法。本文檔共97頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分操作步驟冷凍管準(zhǔn)備保護(hù)劑制備保藏培養(yǎng)物準(zhǔn)備預(yù)凍

—

將程序降溫系統(tǒng)預(yù)冷到4℃，將制備好的冷凍管放入其中，以1℃/min降溫速率降至-35℃；

—

使用程序降溫盒。保藏

將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀?-150℃)或液相(-196℃)。同“－80℃冰箱凍結(jié)法”

本文檔共97頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分液氮超低溫凍結(jié)法保藏時(shí)間長(zhǎng)；保藏效果好，菌種不易退化；對(duì)設(shè)備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對(duì)人員操作水平要求高；保藏成本高。本文檔共97頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分不同保藏方法的比較本文檔共97頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分六、質(zhì)控微生物本文檔共97頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期二\1點(diǎn)40分保藏菌株要求藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。922010版中國(guó)藥典《藥品微生物