基因工程基礎(chǔ)知識(shí)復(fù)習(xí)歸納

1基因工程復(fù)習(xí)歸納第一章緒論1.基因工程的定義：是指按照人們的愿望，經(jīng)過嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，將一種或多種生物體〔供體〕的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體〔受體/宿主〕內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳、并表達(dá)出新的性狀的技術(shù)。2.基因工程概念的開展：遺傳工程→DNA重組技術(shù)→分子/基因克隆〔Molecular/Gene→基因工程→基因操作。應(yīng)用領(lǐng)域以“基因工程〞、“DNA重組〞為主基因工程基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達(dá)出胰島素1982：世界上第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術(shù)誕生1989：我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物rhIFNα1b上市2003:世界上第一個(gè)基因治療藥物重組腺病毒-p53上市3.基因工程的三大關(guān)鍵元件基因〔供體〕：外源基因、目的基因載體：能將外源基因帶入受體細(xì)胞，并能穩(wěn)定遺傳的DNA分子〔克隆載體、表達(dá)載體〕。宿主〔受體〕：，能攝取外源DNA、并能使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞〔組織、器官或個(gè)體〕。摩4亂.基蜂因工歐程的耀根本蠟步驟慘〔對(duì)切、泛接、墳轉(zhuǎn)、齒增、暫檢〔線大腸晴桿菌拐是中堪心角疤色〕舊〔1匹〕目盜的基喇因的家獲取慎：巴從復(fù)舞雜的憤生物小基因?qū)毥M中犧，經(jīng)竭過酶干切消戲化或盈PC霞R舌擴(kuò)增沒等步贈(zèng)驟，鍛別離處出帶崇有目授的基詳因的雙DN覽A辣片斷禿。幟假設(shè)〔2類〕重靠組體寒的制妥備：波將目爆的基停因的那DN過A有片斷敲插入貨到能酬自我英復(fù)制田并帶高有選奮擇性柏標(biāo)記性〔抗憶菌素雨抗性晚〕的螺載體旨分子承上。仔趴〔3哥〕重同組體走的轉(zhuǎn)療化：全將重孕組體晝〔載渣體〕豐轉(zhuǎn)入捷適當(dāng)增的受徒體細(xì)券胞中素。跨直〔4偉〕克堵隆鑒號(hào)定：純挑選室轉(zhuǎn)化被成功首的細(xì)薪胞克排隆〔以含有很目的蜘基因落〕。近竭〔5泊〕目都的基辨因表緣達(dá)：熟使導(dǎo)牌入寄猴主細(xì)比胞的紋目的閘基因控表達(dá)停出我認(rèn)們所隔需要齊的基夕因產(chǎn)產(chǎn)物。太暖第二轎章訪DN肝A重井組克水隆的以單元才操作京一、網(wǎng)用于漂核酸侄操作淚的工踩具酶角1.朱淘限制陪性核廊酸內(nèi)給切酶傅(絡(luò)主要舌存在塘于原區(qū)核細(xì)設(shè)菌中閥，幫斥助細(xì)冠菌限詢制外粗來D糊NA歡的入處侵劃)棋。琴限制問性核崗酸內(nèi)藏切酶剪的功伐能與翼類型膠主要挑特征體I島型像II型型抱II聽I(yíng)惜型撥功能債限切亦/修藥飾買限切均限切叛/修澡飾達(dá)蛋白誕結(jié)構(gòu)旺異源姥三聚哲體虹單體性異源武二聚嗓體頭輔助旬因子尺AT歷P炊Mg出2+誦S偷A(chǔ)M推Mg伴2+乘AT瑞P勞Mg捆2+典S殿A(yù)M吳識(shí)別銳序列鏈TG社AN駛8至TG竟CT指AA唉CN捷6究GT窄GC年旋轉(zhuǎn)們對(duì)稱愈序列扎GA凳GC店C炮CA羞GC籠AG攻切割聯(lián)位點(diǎn)譯距識(shí)漏別序綁列1帆kb勾處疏識(shí)別蒙序列倡內(nèi)祖距識(shí)嫩別序斜列下嫌游糕24負(fù)-2師6b更p處強(qiáng)其中畢II紡型限垮制性板核酸盯內(nèi)切痛酶：怨切割毅位點(diǎn)柱專一餅，適課于D賄NA惹重組慣，是饞DN岡A重組組中嗓最常侄用工不具酶應(yīng)。拆特點(diǎn)畜：社1.攝識(shí)別跪、并供切割說雙鏈良DN適A分商子中淚特異擁序列咸的D剛NA己內(nèi)切醉酶。裝2.盾識(shí)別戰(zhàn)序列別為4尺-6烈堿基求對(duì)的預(yù)回文患對(duì)稱訓(xùn)結(jié)構(gòu)爬〔旋偉轉(zhuǎn)對(duì)制稱結(jié)娘構(gòu)〕莖。3稿.鐵單體誼蛋白買、僅神有限壯制性每?jī)?nèi)切狡酶活勸性，東無甲熱基化拐酶活摧性他。4乞.衛(wèi)切割丟產(chǎn)物繼末端畝：次5徐’責(zé)突出筐末端繡、3送’安突出盼末端記、平股頭末駝端息.6督.等最適煩溫度俗：大蘋多為虹37妙℃夢(mèng),蘇適鹽口濃度芝：高棍鹽、未中鹽庸、低動(dòng)鹽孟。8嶼.街當(dāng)反段應(yīng)條筑件不落適合醫(yī)時(shí)，鋼識(shí)別激和切威割序演列發(fā)吸生變胖化堅(jiān)〔星沾號(hào)反身應(yīng)〕疼。杠星活巾性〔鈴st右ar問a致ct姥iv燦it遠(yuǎn)y〕勾：潔在極志端非線標(biāo)準(zhǔn)山條件套下，脾限制瘋酶能腳切割預(yù)與識(shí)寶別序君列相纏似的揉序列聞，這撇個(gè)改很變的快特殊旺性稱級(jí)星活山性。蔽引起慌星活頂性的營(yíng)因素蛛：酸踐①肚高加濃度右甘油肅〔>零5%蔥〕斜、握②堪酶允過量鞭〔>扎10孩0U依/秒m仇g〕頂、找③邊低乏離子欠強(qiáng)度腸〔<唇25舍mM勤〕鉛④恥高纖pH露(瘡>p環(huán)H8朽.0吧)于、貴⑤驅(qū)有幫機(jī)溶巖劑芬、稠⑥靈用房其它濟(jì)二價(jià)駱陽(yáng)離伯子代燙替M能g2手+決，如議Mn暑2+虹，C聯(lián)u2臨+，標(biāo)Co另2+中,城Zn絹2+趨。播II阻型限綱制性蹄核酸踩內(nèi)切株酶的歇命名必具體月規(guī)那么壽是：駁以生錯(cuò)物體太屬名秧的第斥一個(gè)冠大寫景字母柴和種皺名的激前兩典個(gè)小前寫字筆母構(gòu)暮成酶買的基跑本名死稱，即如果叨酶存擺在于圖一種蘇特殊莫的菌絨株中甘，那么墾將株扇名的令一個(gè)詠?zhàn)帜笘|加在點(diǎn)根本司名稱河之后卷，假設(shè)定酶的圾編碼溝基因籮位于熄噬菌蹲體〔讓病毒給〕或罷質(zhì)粒難上，森那么還扒需用欄一個(gè)贊大寫訊字母飯表示偽這些烘非染搶色體南的遺鉛傳因領(lǐng)子。大酶名青稱的恨最后匹局部恰為羅福馬數(shù)伍字，否表示悔在該此生物顧體發(fā)滅現(xiàn)此騰酶的驢先后平次序局。聾例子灑：標(biāo)Es枯ch吉er訴ic琴ha趙〔屬骨名〕慘co置li逼〔種信名〕愿R鉤〔質(zhì)雁?！嘲Y大腸疊桿菌崗R質(zhì)盡粒偵—句Ec志oR籍嘉I紛尸Ec蔽oR失齊V炕Ha姐em倦op座hi蓋lu民s率〔屬蹦名〕腦i干nf炭lu驚en帖za闖e晃〔種筍名〕叔田d〔塑株名餡〕喚嗜蓋血流亮感桿膀菌d擠株-內(nèi)-榮劑H菜i突n藥d安做II歲瓶萄昌企誕H智i稻n恰d腔南II準(zhǔn)I襖。羅鄭馬數(shù)但字表簡(jiǎn)示匠同一煉菌株睜中所啊含的宇多個(gè)愁不同勿的限寺制性膨核酸銷內(nèi)切伐酶需。冬特殊購(gòu)性質(zhì)銷的I鉤I型括限制霞酶：?jiǎn)T同裂怕酶，省同尾康酶勉同裂尺酶祝：玉又稱董異涉源同嚼序酶迫或異遼源同旬工酶凱，是濕指咬識(shí)別作位點(diǎn)零與切柜割位付點(diǎn)均驅(qū)相同毯的不識(shí)同來雨源的悄酶爽識(shí)別嘉相同胡序列懸，如顏Hi廚nd研II白I粘–傍H松su誓I:蘆A端/兄A漆GC啦TT幟同尾滿酶：揭是指宣識(shí)別臂位點(diǎn)踐不同走，但徑切出羅的Ｄ貌ＮＡ聚片段辛具有始相同沉的末毛端序斯列敢的一裳類酶京，如寄Bg妹lI鞭I痰：劣A吸/站GA凱TC狐T僚；環(huán)Ba裂mH叼I:凝盞G胡/盾G始AT潮CC正。情同尾登酶的廢切割懷產(chǎn)物甘互為厚粘性糞末端渠，并滅能連最接，躍但連待接后播二個(gè)察酶的板識(shí)別錫序列焦均被單破壞防。掩2.閃DN崖A連炕接酶辜〔T字4-乓DN搞A連暢接酶玩〕吐功能旺：印體外燕連接詞ＤＮ爭(zhēng)Ａ片抽段櫻常用蒸的連肌接酶副：夾Ｔ４似Ｄ耐ＮＡ涂連接拒酶漿參與蹲連接蠶反響琴的基津團(tuán)：夜３端加羥基頌和５顫端磷侄酸基鉆團(tuán)，濤形成素磷酸沖二酯誤鍵處DN稅A連索接酶糞的基悅本性粉質(zhì)舍：傅修復(fù)盛雙鏈蒜DN談A上衣缺口趟處的龍磷酸繭二酯吐鍵、花修復(fù)極RN否A-社DN掏A雜悔合分爭(zhēng)子中階DN駝A鏈對(duì)上缺撥口處粥的磷拴酸二式酯鍵注、連擊接多窯個(gè)平殊頭雙眠鏈D幸NA挨分子枕T4重D疲NA核連接矩酶的洽活性膀單位捉定義熔：先在隸20煌μ拔l境反響躺體系躺中于磁來16倒℃基，暑使益H天in企d甩Ⅲ虜切忙過的訓(xùn)驕l羅D犧NA喚〔柄30捷0耍μ愛g/衫m(xù)l眉，0夜.1捆2兼μ叛M歇5'駐末油端〕續(xù)在撥30皆分摸鐘內(nèi)章連接漂5艱0%給所兵需的療酶量黑為托1引個(gè)成NE簡(jiǎn)B訓(xùn)單位恐。哲3奧.D蝶NA喝聚合慮酶胡①狼大腸喬桿菌瞞DN囑A聚餡合酶芬I泥〔還DN襪A默po應(yīng)l漸I色〕散根本吳性質(zhì)極：惑1.尊米5霉‘林→荷3薯‘窗的D唱NA淋聚合并酶活村性雨2留.孝硬5奇‘該→宵3催‘陽(yáng)的核驅(qū)酸外逆切酶爛活性脈3獻(xiàn).浩亦3穗‘陜→棟5決‘柔的核嶺酸外險(xiǎn)切酶請(qǐng)活性膚大腸跡桿菌袍DN曬A聚汽合酶濫I雞的雄根本蓄用途星：卡1.芳切口口平移涉標(biāo)記鴨法異2尺.辭Ni閱ck躺t帝ra救ns奮la嬌ti迷on右3弄.團(tuán)制備笛32銀P標(biāo)嚼記的攔探針井。磁所有指的袍DN泛A鹿聚合良酶中術(shù)只有洗此酶磁有該鍵反響蛇。傳缺口皮平移途標(biāo)記蠶原理忙見p嗎pt帖。盆大腸撥桿菌鄰DN妙A(yù)聚戚合酶焦I清大愚片段洲〔銅Kl悅en越ow六酶歡〕逃：晶大腸每桿菌課DN視A聚震合酶套I經(jīng)茶枯草逝桿菌裳蛋白跪酶處啞理，族獲得備N端通三分出之二映的大涼肽段蕩，即窮為K綁le綢no沿w酶頭。臉Kl慣en流ow紋酶仍蠻擁有像5僚‘惑→忍3愧‘算的D填NA施聚合員酶活敞性和摘3敞‘正→儀5繡‘瀉的核陜酸外載切酶郊活性燈，但幟失去晌了根5院‘咐→仆3織‘燒的核蔥酸外榨切酶壞活性碑。立Kl融en倒ow疏酶的醬根本希用途秋：他1.縮補(bǔ)郵平由酒核酸捎內(nèi)切斯酶產(chǎn)磁生的煙5喉‘逝粘性維末端澡2培.D連NA國(guó)片段秀的同租位素隔末端隊(duì)標(biāo)記直3輛.c償DN僑A第奉二鏈小的合碧成湖4.主雙脫洗氧末莊端終泥止法握測(cè)定剛DN欄A序俗列。丟②傷T4放-D浩NA蒜聚合投酶即根本瘡特性華：需1.付5縣‘凡→鑼3外‘偷的D港NA賞聚合色酶活瓣性和加3奪‘經(jīng)→鈴5烤‘怕的核羅酸外抬切酶闊活性馬(極釘強(qiáng))悶2警.于后在無打dN形TP途時(shí)，線可以巧從任旺何3杰‘引-O充H端辭外切僑3渡.丸在四企種d攪NT作P均豈存在丙時(shí)，漲聚合柳活性疲占主峽導(dǎo)地仆位期根本扛用途推：1匹.匹切平納由核蒜酸內(nèi)莖切酶迅產(chǎn)生懼的3糟’灶粘性糊末端鋼，晴該酶脊也能腰降解典雙鏈報(bào)DN顆A，淡只是飯其活脖性比肅單鏈燒降解富活性慧低很堅(jiān)多塑。2廈.案DN查A片哄段的話同位渣素末首端標(biāo)貓記直。配③材依賴每于R斯NA礎(chǔ)的D煎NA股聚合英酶〔流反轉(zhuǎn)容錄酶己〕俗根本鉗用途旋：1倘.稍以R衰NA采為模絞板合逐成c境DN背A鏈宇2草.態(tài)雙向癢外切瓜DN擋A-寨RN證A雜步合鏈各中的策RN獎(jiǎng)A鏈載4.但核酸猛酶辰單鏈兼核酸爭(zhēng)外切宏酶：席核酸符外切撲酶V拉II退〔E持xo身VI捆I〕攀；雙沾鏈核躍酸外鉗切酶采：核棕酸外行切酶節(jié)I墳II吃〔E比xo偏I(xiàn)I倡I(xiàn)〕搭；雙炊鏈核擾酸外繼切酶功：灰λ粗核酸留外切潔酶〔虜λ漏Ex摔o〕斜【特糖異性挺地從玩5纏‘魂端積外切拼】；劃單鏈戒核酸茄內(nèi)切暑酶：話S1池核酸顯酶【艷降解參單鏈腫DN辱A的索速度付比降己解雙借鏈D延NA舍快7楊50閘00勾倍，唯比降鏟解單觀鏈R粗NA追快7廳倍】槍5．脾核酸遇修飾搬酶恰末端方脫氧眉核苷胃酰轉(zhuǎn)場(chǎng)移酶碎〔T伴dT挪〕賣；角堿性販磷酸璃單酯貪酶【祖小牛擇胸腺過的堿控性磷嚇?biāo)釂紊絮ッ竿ァ睠桶IP胃〕&隊(duì)大腸渾桿菌撒的堿杜性磷妨酸單事酯酶盡〔B言AP里〕】掘；T匙4-晉多核悉苷酸瘋磷酸擋激酶鮮〔T框4-粗PN刑P〕垮二、禽用于座克隆屢的載勤體它1.項(xiàng)業(yè)載體深〔V瘦ec燕to抵r〕掌：陣是把齊外源軍DN驢A〔助目的毒基因腫〕導(dǎo)鴨入宿離主細(xì)妻胞，商使之擔(dān)傳代牢、擴(kuò)宗增或零表達(dá)蔬的工撓具?？d體漂應(yīng)具小備的鞠條件戰(zhàn)：蹲1粗.臨具有炒針對(duì)倦受體亦細(xì)胞挨的親光緣性淡或親束和性誠(chéng)〔可墨轉(zhuǎn)移憐性〕演2.漆貫具有凍與特色定受芳體細(xì)鬼胞相筐適應(yīng)徐的復(fù)耀制位孕點(diǎn)或誼結(jié)管合位喝點(diǎn)泡餡3.茄具禽有較綱高的參外源睬DN械A(chǔ)的劍載裝攝能力奉4鳳.宵具有咐多種楚單一還的核極酸內(nèi)職切酶品識(shí)別案切割鋒位點(diǎn)壤(濟(jì)多克今隆位倚點(diǎn)潛)桑5征.職具有足適宜頂?shù)暮Y符選標(biāo)陵記暑2.悄載體郵類型敘：跳〔1駛〕勤根據(jù)欠主要秘用途麗可以捆分為鵝：盜克隆口載體索和表黑達(dá)載鏟體叔①臟克隆耗載體舍：趕主要我用于忍在大胳腸桿利菌細(xì)拳胞中希克隆妖目的射基因尊，或哥在大根腸桿哥菌或觸釀酒省酵母柳細(xì)胞禍中構(gòu)撈建基房因文見庫(kù)。弄克隆搭載體聯(lián)關(guān)鍵乏元件殲：雜A.勾多克釣隆位漁點(diǎn)液B.您篩選乎標(biāo)記厭基因魔C謙.復(fù)嗎制起驗(yàn)始位豪點(diǎn)=2\*GB3兔②只表達(dá)烈載體滔：驕除含跪基因司克隆秋所需南元件配外，公還有頂供外朝源基釋因表抓達(dá)用惑的啟盼動(dòng)子復(fù)、終禁止子恩等順添式元戴件，糖用于管在特穿定的艱宿主乳中表敢達(dá)目赤的基耳因。怕〔2掛〕各按傳黑代特蝦性分伸：引①掃自主咬復(fù)制殊型載塑體：莖含復(fù)剖制子雹，可盆獨(dú)立粉于宿銜主染懇色體倚外復(fù)袋制與故傳代余〔宜穿梭瞞載體徹：廉裝有吩針對(duì)辭兩種糾不同叔受體吃的復(fù)女制起榨點(diǎn)，圓便于困基因誦克隆顧〕。=2\*GB3披②口整合縱型載蹦體：翻不含光復(fù)制忍子，捎需借再助同笛源重澆組機(jī)卵制整息合于例宿主日基因拍組。越3.架分子叨克隆云載體鐮常用餐類型權(quán)：吉〔1桐〕躺質(zhì)粒欣：仆15撤kb蘿以下餃消恭凱嚴(yán)緊今型復(fù)索制控旋制的廊質(zhì)粒塵：1茂-解5蓬拷貌貝，饞如p蹦SC碰10娃1窯帶誤寄松弛丟型復(fù)村制控通制的掩質(zhì)粒希：3款0薯-包50看拷倡貝，趨如上Co高lE絨1犧氯霉頓素?cái)U(kuò)什增：鞠在宿荷主菌璃生長(zhǎng)流的中壇后期套，通伙過添擺加氯觸霉素的抑制腐蛋白腎質(zhì)合壺成、披關(guān)閉儲(chǔ)主要迷代謝補(bǔ)途徑遼，以炒使松勉弛型促質(zhì)粒沙估迅速道大量踐擴(kuò)增貫〔可同達(dá)上命千拷行貝〕于的操系作。短質(zhì)粒紫載體蔽的特柳點(diǎn)：遲分子繡量小裳，便劣于操塊作；姥易于搶構(gòu)建紙，可訓(xùn)作為漠其他街宿主犯系統(tǒng)額載體承的骨枝架；野用途所廣泛載；缺概點(diǎn)：亂裝載眨量小篩〔小杜于1雁0k懂b〕鹽，不卸能用莊來克斬隆大涉片段陸。然重要駁的大膜腸桿友菌質(zhì)密粒載娘體梨：僵pB校R3菠22前：松族弛型續(xù)復(fù)制左；氯事霉素之可擴(kuò)怨增；姥拷貝碰數(shù)饞50轟竭–墨1午00冠/炎c暫el順l；術(shù)用于驕基因圍克隆纖。還迎有資pU象C1縫8/斧19歸；T嚇載體吐，受詳見口pp愉t，站了解劉一下競(jìng)。貞實(shí)驗(yàn)外室一爐般使士用下宜列三股種方粗法制駛備質(zhì)敏粒D雷NA桂：簡(jiǎn)氯化皺銫密應(yīng)度梯堪度離罪心法什：蘋質(zhì)粒匙DN眾A純清度高繪、周砌期長(zhǎng)仰、設(shè)郊備要乒求高阿、溴掩乙錠凡污染肺；效②暢堿裂本解法賺〔最途常用裁〕：托質(zhì)粒歲DN蝶A純琴度、訊操作燒周期訓(xùn)介于餅氯化遞銫法圣和沸椅水浴訓(xùn)法之蹄間除；預(yù)③渾沸水置浴法浸：盞質(zhì)粒牧DN珠A純夏度底狀、快勇速、害操作塞簡(jiǎn)便排。意質(zhì)粒最的不止相容止性的檔分子謀機(jī)制灣兩種搬含有亞相似骨復(fù)制濁子結(jié)希構(gòu)的合不同巾質(zhì)粒昨，在眨復(fù)制杰時(shí)受慚到同紹一種決拷貝桐數(shù)控務(wù)制系街統(tǒng)的懇干擾營(yíng)，致肚使兩勇種質(zhì)泊粒的毀最終籃拷貝虎數(shù)不戶同，哭可導(dǎo)關(guān)致子完代細(xì)壟胞質(zhì)巾粒組呈成不永同，途且這以種差漏異具辟隨機(jī)祝性，勻經(jīng)過鐘假設(shè)干做代后途宿主黑細(xì)胞災(zāi)中處室于數(shù)完量弱慈勢(shì)的施質(zhì)粒核必然部被淘斷汰，敞而僅點(diǎn)剩強(qiáng)芒勢(shì)質(zhì)眠粒?；①|(zhì)粒享載體惠不穩(wěn)花定性也的類醒型籌別離殃的不帳穩(wěn)定株性：捉在細(xì)牙胞分編裂過感程中閣發(fā)生柜的質(zhì)已粒不悶平均齡的分派配，慎有的呼細(xì)胞論沒有嗓獲得國(guó)質(zhì)粒鋤D脖N彼Α賞拷貝挖，并甘最終廟增殖河成為耗無質(zhì)漫粒的窩優(yōu)勢(shì)磁群體券?？Y(jié)構(gòu)影的不儉穩(wěn)定拐性：嬸由轉(zhuǎn)網(wǎng)位作顯用和停重組漂作用旦所引巧起的攪質(zhì)粒稍DN逐Α伶的重妄排與婆缺失承。株影響肺質(zhì)粒扔載體差穩(wěn)定吧性的抵主要燙因素羊新陳緊代謝掩負(fù)荷壽對(duì)質(zhì)謝粒載米體穩(wěn)毅定性趟的效假應(yīng)；們拷貝得數(shù)差毫度對(duì)椅質(zhì)粒訪載體訓(xùn)穩(wěn)定閉性的杰影響拉——伶低差相度悟-團(tuán)穩(wěn)定迷/蕩高禿差度萌-隊(duì)不穩(wěn)族定；飲寄主桑重組晶體系球?qū)|(zhì)滔粒載餓體穩(wěn)劣定性斃的效帽應(yīng)債——灑形成炮重組它質(zhì)粒委二聚禁體，評(píng)便會(huì)歐以高輩出質(zhì)背粒單過體分退子兩曬倍的倚速度各進(jìn)行孔復(fù)制張，從重而導(dǎo)招致出尋現(xiàn)質(zhì)炭粒寡臘聚體佩的克梨隆增右殖攏。觸〔2洽〕葛la節(jié)md程a噬抵菌體賽DN欣A:徑鄭25蒙kb藍(lán)λ劑噬菌撐體是錫大腸計(jì)桿菌遇的溫僵和型貌噬菌煮體，勿由外疏殼包暗裝蛋插白和抬l暴-D眼NA踩組成殺。D緣NA蕉重組鋼技術(shù)倍一般床需要巡λ妥噬菌煩體進(jìn)鏟入籠溶菌趨狀態(tài)豬λ焦-D崖NA吉是線遠(yuǎn)性雙蝴鏈D茶NA用分子增，全斧長(zhǎng)4亞85慰02屬個(gè)核然苷酸軍。繩λ錫-但DN脹A套兩端蔑各帶寇有一慨個(gè)吉12賤bp饅的粘迅性末片端，蹲稱為霜co陵s居位點(diǎn)極。噬久菌體李感染司細(xì)菌允以后魄，雙癥鏈榴DN揀A李分子小通過擁CO羨S收位點(diǎn)萬成環(huán)圾狀識(shí)。油①釀插入君型載分體欣：炸改造彩后的揀長(zhǎng)度釘正好咳為包略裝的圈下限平，因貌而本利身也概能被沸包裝卵，叫柏插入釋型載惑體避1.鬧cI恐基因飾失活鴨：c瞎I基守因失桿活后磚將導(dǎo)君致噬頃菌體虜不能萄溶原祥化，艘產(chǎn)生侄清晰壁的噬仰菌斑綁。相倍反，者產(chǎn)生源混濁澤的噬布菌斑尊。始2.領(lǐng)L散ac夢(mèng)Z滿基因話插入兵失活插：塑在l旗ac煤Z覽基因鞠上有貌Ec喜oR機(jī)I無位點(diǎn)王，插泳入失敗活后假利用麗X-逗ga源l法牛篩選完〔藍(lán)初白篩伴選〕似。春②吉取代璃型載衫體約：妥長(zhǎng)度膏為句40工kb搭，在壇非必膽需區(qū)輔域有考酶切嚷位點(diǎn)完，距腥離為銹14楚kb老。礦載量備為1跳0-萬25享kb獅。汽用取娃代型芽載體稍克隆蔑外源夕DN倆A可型能需童要經(jīng)插過哪索些步厚驟？禍第一甩，應(yīng)贊用適妖當(dāng)?shù)谋亢怂岜硟?nèi)切品限制兔酶消渴化漸λ掩載體爛，除事去基尾因組心中可威取代愁的鑄DN遍A車區(qū)段夏。漿第二洪，將柏上述聽所得很的好λ穿D子NA乏臂同攀外源支DN殿A(yù)遮片段用連接御。第填三，踏對(duì)重抽組體厚的仙λ巧DN沸A螞分子涌進(jìn)行辛包裝遙和增馳殖，霞以得掌到有蕩感染磨性的白λ染重組罪噬菌踢體。趟λ蒸-D竭NA時(shí)重組馬分子霜需在別體外質(zhì)人工憐包裝凝成有果感染嘆力的育噬菌效體重夸組顆玩粒，位方可乞高效殿導(dǎo)入銀受體忍細(xì)胞回。優(yōu)λ撞-D拼NA捎作為半載體樓的優(yōu)村點(diǎn)文：死1.毛善λ高-D漢NA壟可在種體外蘭包裝它成噬崇菌體土顆?；?，能繳高效喂轉(zhuǎn)染礙大腸認(rèn)桿菌畝色2.杰λ歐-D耳NA圾載體浩的裝滾載能姓力為涉25術(shù)k捎b，鬼遠(yuǎn)遠(yuǎn)顧大于促質(zhì)粒買的裝河載量舅3物.告重組臣l督-D罰NA哨分子弊的篩兼選較絹為方紅便摟致4.壩克重組瘡λ增-D似NA蚊分子功的提疼取較演為簡(jiǎn)敘便災(zāi)鎮(zhèn)5.逃辱λ增-D憐NA懼載體椒適合暮克隆聯(lián)和擴(kuò)撤增外如源D比NA貧片段與，但挺不適葬合表法達(dá)擦外源打基因胸。帥co放s質(zhì)鑰粒：廚la好md斗a灘D蠶NA服的c布o(jì)s逐區(qū)和綱質(zhì)粒身組成哲的載音體:姥3晝1-鑒45殺k統(tǒng)b布〔3霜〕秘考斯右質(zhì)粒輝載體誘的特鴿點(diǎn)：賺1.學(xué)能像艘λ抹-D悼NA寄那樣剖進(jìn)行伐體外焦包裝精，并途高效世轉(zhuǎn)染督受體響細(xì)胞蜘2.豎能像砌質(zhì)粒舅那樣醫(yī)在受裂體細(xì)歪胞中按自主匪復(fù)制精3跌.佩重組已操作經(jīng)簡(jiǎn)便霧，篩乏選容由易責(zé)4.案裝慶載量嶼大〔鹽45煙k謎b〕仍且克暑隆片號(hào)段具酷有一晉定的孩大小傷范圍西5并.詳不能競(jìng)體內(nèi)遭包裝氧，不啦裂解厲受體啞細(xì)胞加.駱〔4躬〕人彈工染剩色體旗載體昨人工扔染色攻體頌實(shí)際私上是超一種棕“木穿梭殊〞盡克隆非載體堂：含授有質(zhì)橡?？肃嵚≥d章體所雙必備舊的第籠一受肅體〔溜大腸身?xiàng)U菌雖〕源凝質(zhì)粒送復(fù)制閣起始年位點(diǎn)燕〔o罵ri航〕，位還含紫有第患二受蘆體〔吊如酵著母菌顧〕染勁色體被DN益A著交絲點(diǎn)牢、端喬粒和怠復(fù)制究起始棟位點(diǎn)百的序戴列，報(bào)以及范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ǔ)部基健因〕遠(yuǎn)&宰cD扎NA奏文庫(kù)浪〔含拜有全初部蛋斗白質(zhì)免編碼擾的結(jié)燕構(gòu)基偉因〕捉。甩在高躬度分鴿化的貢生物磚體中梯cD腦NA劇文庫(kù)棍的信立息量尖遠(yuǎn)小灶于基更因組并文庫(kù)心基因例克隆耐常用遞方法踏：臭①區(qū)鳥槍新法脂根本群策略披：關(guān)染色擺體D葬NA帽的切醫(yī)斷俱：超嫌聲波掙處理裝——纖片段膜長(zhǎng)度擦均一辱，大圣小可份控，主平頭添末端睛；傻全酶敬切意——紙片段效長(zhǎng)度隨不均騎一，使粘性鉆末端晴便于開連接符，但爺有可動(dòng)能使頃目的斃基因減斷開浴，龜大小弄不可誕控；事局部岸酶切你——褲片段畢長(zhǎng)度廁可控似，含少有粘街性末谷端，鞏目的飄基因辮完整情。帳與載蠅體連榜接脈：氏如果久轉(zhuǎn)化浸子采稻用菌含落原略位雜諒交法奔或限角制性歲酶切徒圖譜端法篩參選，聲那么選梅擇多蓄拷貝準(zhǔn)克隆互載體儲(chǔ)；如蒼果轉(zhuǎn)嗎化子鎖采用煮基因尤產(chǎn)物撈功能玉檢測(cè)獵法篩肢選，蝕那么選備擇表順達(dá)型拋載體課。央轉(zhuǎn)化段受體粱細(xì)胞應(yīng)——衡如果變轉(zhuǎn)化申子采術(shù)用菌沉落原歲位雜漆交法幻或限肥制性茂酶切搏圖譜杰法篩追選，此那么選惕擇大劣腸桿橋菌作烈為受語(yǔ)體細(xì)境胞；歉如果漫轉(zhuǎn)化宰子采殖用基粗因產(chǎn)皺物功屆能檢生測(cè)法控篩選抵，那么緒選擇舊能使少目的羅基因葛表達(dá)森的受箱體細(xì)筐胞獸。齒篩選教含有膝目的逃基因彩的目瘋的重共組子吊：筋菌落格原位障雜交臂法、屬基因捐產(chǎn)物歉功能競(jìng)檢測(cè)謎法〔冰篩選仍模型矮的建屯立〕泉。顯②立cD豆NA傍法巖根本鉗策略枕：著【c后DN垃A第且一鏈評(píng)的合匙成賣→獲cD貌NA慎第二職鏈的霸合成盆〔自六身引體導(dǎo)法愚、置匪換合芒成法棉、引辨導(dǎo)合蝴成法匠、〕繁】/鼠雙鏈撿cD遙NA熟的克安隆帖萬→借離目秒的基爺因〔砌完備誘別離蕩程序框、特制異分灑離程俘序、樣差異炕別離宴程序壞〕突③頂PC盞R法使使用倘PC掙R法釋克隆駱目的便基因較的前住提條絮件是棋：已占知待銀擴(kuò)增賠目的創(chuàng)基因踏或D重NA迅片段蛇兩側(cè)跑的序爐列，籠根據(jù)賄該序墊列化送學(xué)合志成聚樣合反送應(yīng)必態(tài)需的摸雙引封物辰根本領(lǐng)策略父：夢(mèng)由T鬼aq納D拆NA療聚合舊酶擴(kuò)括增的沸PC氧R產(chǎn)嚴(yán)物中載，其三3懸’概末端精總是麗會(huì)帶吧有一瑞個(gè)非趟模板攻依賴瞇型的迎突出遼堿基料，而陪且這瓦個(gè)堿虛基幾救乎總最是A評(píng)，因憑為T欣aq娃D(zhuǎn)屬NA災(zāi)聚合李酶對(duì)饞dA葉TP鬧具有云優(yōu)先匹聚合惕活性辱。由夏于該緒突出曠堿基塌的存柔在，珍克隆爸時(shí)即那可以薯采取笑Td冷T末腰端加螺同聚盜尾的夸方法單與載堵體拼閃接，哄也可價(jià)以使婦用專街門的假設(shè)T載圍體克結(jié)隆居。邊④鹽化學(xué)循合成搖法著〔全哥基因?yàn)V合成致〕殿基因役文庫(kù)纖的完偷備性香是指豬：于在構(gòu)臟建的敗基因啟文庫(kù)悼中任標(biāo)一基始因存愁在的乞概率陣，它煩與基齒因文我?guī)熳罾鄣退春藧偮?shù)莫N之氧間的松關(guān)系虎可用窯下式徒表示針：N貪=教l曲n銳(娃1邪–姓P譯)翅/善l既n業(yè)(筑1今–責(zé)f蟻)息其中息：叉P兔=廟任一虜基因掃被克告隆〔詢或存市在于賽基因界文庫(kù)評(píng)中〕物的概抵率，腫f庸=霧克隆惹片段均的平扒均大杜小罰/紅生物走基因巷組的駕大小危。玩基因法文庫(kù)值的構(gòu)藍(lán)建程云序指1.灰基因黑組D冷NA攏的制宿備：在2.走基因觀組D鏟NA閑的切陪割：縮用于客基因改組文奇庫(kù)構(gòu)成建的房DN瘋A片緩段的揉切割殺一般緩采用伯超聲紋波處懼理和買制性肝內(nèi)限立切酶皆局部際酶切愉兩種裙方法栗，其鞭目的表是：仆第一曾，保彎證D陶NA慕片段珍之間旁存在昏局部段重疊事區(qū)；看第二禾，保萬證D皺NA建片段厚大小伐均一呼。連仍接前鈴，上禁述處關(guān)理的腔DN為A片北段必公須根澇據(jù)載粥體的半裝載葡量進(jìn)己行分貫級(jí)分狼離，忍以杜衡絕不綁相干錯(cuò)的D繼NA運(yùn)片段集隨機(jī)聯(lián)連為嶄一體起3.替載體頃和受智體的企選擇剃：出擠于壓即縮重城組克員隆的扒數(shù)量險(xiǎn)，用腳于基旬因組公文庫(kù)羞構(gòu)建級(jí)的載悔體通班常選等裝載關(guān)量較秀大的防λ范-D拖NA陡或考陳斯質(zhì)糾粒；坦對(duì)于技大型蛛基因列組〔鼠如動(dòng)徹植物翅和人怒類〕企需使閱用Y按AC尸或B梯AC營(yíng)載體外。c丟DN打A文窄庫(kù)構(gòu)昨建的舉載體更通常尤選質(zhì)蓋粒；愁用于鹿基因?yàn)⑽膸?kù)震構(gòu)建任的受拐體那么亭根據(jù)故載體借使用襖大腸劣桿菌鐮或酵恰母菌炊。難4.損從基顏因文合庫(kù)中便篩選掠目的紹基因擦：可狡以采斧用特?fù)獾膭冋x鄉(xiāng)擇篩揪選程陡序〔古如抗茅藥性恢篩選房法、膽酵母養(yǎng)雙雜垮交技雁術(shù)等甚〕直矮接篩脈選外窗，一暴般的毫基因事組文賺庫(kù)篩兩選均母需多患輪操總作步兄驟。黨原位畜雜交據(jù)法。茅第三技章喉大腸歉桿菌鮮基因竭工程私一、臘大腸稈桿菌徑表達(dá)叮〔生絞產(chǎn)〕裂系統(tǒng)曬的優(yōu)證缺點(diǎn)隨大腸洗桿菌炸表達(dá)綱系統(tǒng)嶼的優(yōu)朱點(diǎn)私1.庸遺傳執(zhí)背景盜清楚咽〔4壺40配5個(gè)綠OR走F〕咱，便移于基廣因操喬作姿2.滲表達(dá)羨水平憲高，厘遺傳拼較穩(wěn)黃定眠3.絮優(yōu)良惹的工括業(yè)性擱能：核繁殖命迅速作、培顯養(yǎng)簡(jiǎn)咬單、園操作釀方便什4型.鵲轟被美澆國(guó)F莊DA傷認(rèn)定師為安士全的菜重組訓(xùn)藥物克生產(chǎn)朵系統(tǒng)性大腸弱桿菌球表達(dá)楊系統(tǒng)賊的缺向點(diǎn)堂缺乏早翻譯棍后修直飾加綠工系旅統(tǒng)〔展不能瘦表達(dá)幕糖基修化蛋管白、洋結(jié)構(gòu)滋復(fù)雜他的蛋伸白等蕩〕2象.胞咳內(nèi)缺嶼乏高粒效的畏表達(dá)巾產(chǎn)物令折疊奇機(jī)制謙〔形名成包反涵體搞〕，襪分泌息機(jī)制碼不完根善據(jù)3.覺細(xì)胞揪周質(zhì)枕內(nèi)含樹有種校類繁言多的掌內(nèi)毒池素鞭二、民大腸懲桿菌參系統(tǒng)蠢高效械表達(dá)偶原理閱①擠大腸熔桿菌襪系統(tǒng)桃表達(dá)微載體續(xù)的基臂本元姻件蔬A、繞目的獄基因沸：編閘碼外燈源蛋湊白的琴結(jié)構(gòu)強(qiáng)基因?qū)払那么、轉(zhuǎn)晨錄元驗(yàn)件：且啟動(dòng)巾子、蒜終止輝子揉C、強(qiáng)翻譯濃元件妥：核棗糖體縫結(jié)合為位點(diǎn)歲、翻分譯起敢始位阻點(diǎn)云D、擊克隆葬元件昨：克燕隆位蠢點(diǎn)、報(bào)復(fù)制耀原點(diǎn)訪、標(biāo)摘記基牛因其E、聽翻譯蓮后元舌件〔鎖非必爬須〕戶：株信號(hào)枕肽、憲融合弓肽剩②讀外源鞋基因望在大重腸桿刻菌中決高效呢表達(dá)槳原理鄭A靠、鹿啟動(dòng)趕子豪(P射ro的mo鵲te至r)谷是D堆NA韻鏈上垮一段申能與悼RN祝A聚批合酶邁結(jié)合宿并能疏起始旁RN賤A合澇成的符序列似。是乒基因鋸表達(dá)我最關(guān)奴鍵類和村最強(qiáng)律的表然達(dá)調(diào)筋控元港件，床啟動(dòng)躍子的姜強(qiáng)弱役對(duì)表采達(dá)水歪平有篇決定肆性影豎響。程〔沒律有啟粒動(dòng)子冷，基愁因就植不能內(nèi)轉(zhuǎn)錄垮〕。僑啟動(dòng)慘子有煉種屬傷特異紋性〔場(chǎng)如真胳核的筆在原坦核宿釣主中儲(chǔ)無效用〕，枕有組桐成型底〔胳組成諒型表勉達(dá)系弄統(tǒng)塑〕而和誘愿導(dǎo)型族〔涂誘導(dǎo)蔽型表肆達(dá)系原統(tǒng)蛋〕斬二大虛類冊(cè)。憤原核怖基因廟啟動(dòng)倒子躬是由萌兩段辜彼此胖分開劉且又騎高度睡保守氏的核摟苷酸處序列嚼組成旨：〔區(qū)1票〕彎Pr村ib側(cè)no瘡w扒盒，泡位于悶轉(zhuǎn)錄鐵起始諷位點(diǎn)摟上游灘5—斃10傾bp艇，一窮般由木6習(xí)～龜8斜個(gè)堿體基組甲成，時(shí)富含東A買和語(yǔ)T霞，故揚(yáng)又稱宿為舉TA殘TA芝盒或麻—1爸0猛區(qū)。甚〔逗2架〕搞—3掀5動(dòng)區(qū)，跟位于匙轉(zhuǎn)錄膏起始搞位點(diǎn)銅上游船35滲bp嚷處，喘故稱奉—3泰5揚(yáng)區(qū)，辟一般沸由駕10德個(gè)堿艇基組疑成。全常用畝原核漸基因恰啟動(dòng)憶子：犁【佛la義c敞(請(qǐng)乳糖泳啟動(dòng)甩子膠)麥；贏tr遇p割(殿色氨藏酸啟碼動(dòng)子近)匙；賭ta趟c揪〔乳呢糖和春色氨刮酸的秀雜合球啟動(dòng)鳳子庫(kù)——榜P邪ta屢c股=步P僵tr漆p理的-年35裕區(qū)+喬莫P窗l(fā)a猾c的部-1礦0區(qū)盯〕；格T7催啟動(dòng)熄子謝】捷——浴IP廣TG扇誘導(dǎo)鞠；侵PL鐮和京PR誠(chéng)(搞λ聰噬菌縣體的吼左向需和右條向啟費(fèi)動(dòng)子蘇)爸——脖溫控褲〔熱善誘導(dǎo)五〕酸，符30點(diǎn)℃敲/刪37具℃普培養(yǎng)惑，奴42頌℃初誘導(dǎo)潔?；腡7聯(lián)啟動(dòng)韻子為——棄最成嫌功的睡啟動(dòng)抬子進(jìn)籌艷款餅杜A.妨強(qiáng)大偏的漢T時(shí)7簡(jiǎn)啟肥動(dòng)子零完全艇專一胞受控癥于盲T括7圾R比NA械聚智合酶壺，局B.學(xué)T元7鄉(xiāng)R藥NA珍聚臥合酶催合成餅m仆RN輪A尾的速矛度比背大腸腦桿菌王RN建A恥聚合悼酶的洲快送5戲倍承C.癥由于舒大腸孝桿菌侄本身孕不含軟T命7紗R差NA欲聚漿合酶添，巾需要兼將外滔源的傅閑T輛7燒R銷NA襖聚俘合旺酶引落入宿伐主菌槍〔采棄用D贈(zèng)E3秒溶源及菌，刪T蘇7痛RN蔑A聚吩合酶菠置于釋La贈(zèng)cU州V5趨啟動(dòng)叨子控頂制下倆，I梅PT凳G間口接誘炸導(dǎo)〕蜂。丸B淡、把終止鈴子想轉(zhuǎn)錄濁過頭給現(xiàn)象惠：護(hù)A.膏RN烈A聚并合酶鈔滑過說終止斃子結(jié)兄構(gòu)繼纏續(xù)轉(zhuǎn)哭錄質(zhì)輝粒上上鄰近萄的哪B.絲DN冷A序散列，耀形成事長(zhǎng)短伙不一隙的m論RN桌A混拌合物嗽。營(yíng)防止田轉(zhuǎn)錄潤(rùn)過頭百策略短：哨A予、采額用強(qiáng)朗終止毫子望——美大腸防桿菌脂rR差NA將操縱中子上尤的r拒rn域T1腦T2桿T7立&噬澆菌體首DN貪A上削的T糧Ф筋丹B哲、二廉聚體龜終止題子串弦聯(lián)的陽(yáng)特殊吉結(jié)構(gòu)伙C掃、守核糖乎體結(jié)除合位扮點(diǎn)〔出RB建S〕炸立mR渾NA習(xí)跪5變’逝端非零翻譯渴序列屢,包肢括S遍D、喬起始液密碼謎子、量SD陶與起峰始密痛碼子俊間的斬序列寧、起礎(chǔ)始密輛碼子牲下游澇序列鎮(zhèn)。碗SD稻序列秩〔S小hi出ne躲-D景al提ga紋rn霸o〕挖：位吵于翻凝譯起各始密表碼子奏上游嚇的6桃-8撥個(gè)核病苷酸特序列饞〔禾5岔’透UA遣AG輕GA屆GG晃世3決’您〕，完它通枕過識(shí)問別大奮腸桿萄菌核男糖體屬小亞缸基中血的1盼6S斯r班RN速A利3果’困端區(qū)行域貨3影’娘AU摟UC滿CU泡CC丹妖5妖’針并與踢之專征一性篇結(jié)合旱，將嘆mR珠NA貝定位律于核林糖體隸上，響從而程啟動(dòng)主翻譯伸。忠D川、尤質(zhì)粒秀拷貝閃數(shù)作價(jià)類策略楚：較增低拷貴貝質(zhì)擔(dān)粒〔唐幾個(gè)胃至數(shù)辜十個(gè)添〕斯&舅調(diào)控科重組方質(zhì)粒鐵的擴(kuò)節(jié)增殿E羅密碼施子樸鐵追滿足飼宿主捐對(duì)密寬碼子估偏愛們性的島策略車:恨外源囑基因芝全合浪成鉛&塔恥同步般表達(dá)港相關(guān)隨tR充NA刪編碼仇基因墓三、裹大腸暢桿菌譽(yù)工程瑞菌的脖構(gòu)建免策略母1、翠包涵權(quán)體型驢異源朝蛋白班的表唯達(dá)算包涵京體悅：早胞內(nèi)紹高效塘表達(dá)透時(shí)，藥工程柴菌因謝大量眾合成舅異源便蛋白擁質(zhì)所糟形成到的水容不溶屯性積唯聚物羽。子性質(zhì)庸：海致密高〔密壓度大塌于細(xì)里胞碎畏片和頸所有辦細(xì)胞掩器〕富、還期含有檔標(biāo)記版蛋白危、R牽NA挽聚合輝酶和軍少量枯的D敏NA機(jī)、R葛NA科和脂砍多糖羨等非務(wù)蛋白孫分子即。裸眼露或蔑被膜瑞包裹尚。菊包涵雪體形變成原擴(kuò)因：藍(lán)大腸范桿菌贈(zèng)細(xì)胞搖內(nèi)呈您“恰復(fù)原瓶〞楊型環(huán)凡境，恥不不礦利于王二硫骨鍵的繼形成蒜，當(dāng)末高效屈表達(dá)霸時(shí)，嗓新合移成肽狗形成備二硫比鍵的香速度遙和折年疊效幟率跟幸不上暑合成肯速度綠。拖表達(dá)坐產(chǎn)物洗結(jié)構(gòu)聾形式度：日a)終局部腔屬于域折疊驕過程畫中的燈產(chǎn)物陶；b梨)部全分為踩無序島卷曲裂與聚懲集，胃分子錯(cuò)內(nèi)二奮硫鍵懷錯(cuò)配揮;淋c代)分咬子間馬存在蘭大量吩錯(cuò)配嚷二硫寒鍵。濃以包輕涵體換形式鉆表達(dá)正目的桐蛋白忍的優(yōu)劉缺點(diǎn)悟包涵尿體表縮達(dá)形絞式的滑優(yōu)點(diǎn)帳：縱①狼、涼便于苗表達(dá)魔產(chǎn)物守別離后——舍包涵筍體的葬水難非溶性詳及其冰密度盛遠(yuǎn)大舍于其袍它細(xì)盤胞碎麗片和眾細(xì)胞雀成分云，菌夫體經(jīng)聚超聲爪波裂埋解后甚，直根接通床過高捕速離玻心即俗可將盆重組太異源理蛋白踩從細(xì)滾菌裂引解物汗中分貝離出縣來單②堅(jiān)、巷利于郊表達(dá)奶產(chǎn)物興在宿御主細(xì)銜胞內(nèi)乒穩(wěn)定錢存在追——秀在形姿成包忽涵體磚之后跑，大布腸桿影菌的系蛋白嗽酶降煩解作雅用基堵本上禾對(duì)異罪源重詞組蛋毛白的胸穩(wěn)定史性已遺構(gòu)不剛成威資脅年包涵和體表陡達(dá)形受式的崇缺點(diǎn)冶：越——捷以包越涵體反形式繡表達(dá)船的重值組蛋陷白喪鈔失了儉原有院的生潑物活銷性，擾必須咬通過維有效創(chuàng)的變尿性復(fù)帶性操構(gòu)作，煤才能葛回收灶得到紫具有臉正確口空間曠構(gòu)象涌〔因創(chuàng)而具網(wǎng)有生侍物活嗚性〕冶的目滾標(biāo)蛋史白，共因此殊包涵監(jiān)體變碑復(fù)性憐操作珍的效毒率對(duì)綢目標(biāo)刮產(chǎn)物粉的收匙率至爐關(guān)重觸要。撫然而釣，這肥也是垮一個(gè)癥技術(shù)響難題州，尤騙其當(dāng)短目標(biāo)鳴蛋白競(jìng)分子語(yǔ)中的成Cy火s殘民基數(shù)吩目較零高時(shí)奸，體孕外復(fù)扶性蛋漢白質(zhì)械的成樸功率絨相當(dāng)粘低，禾一般懲不超史過3頌0%乎。豆包涵去體的腫溶解婦與變間性取湯意包涵升體的端溶解借與變民性的頸主要跡任務(wù)而是拆泉開錯(cuò)寶配的聾二硫春鍵和油次級(jí)泰鍵在疑人工頑條件竭下，杜使包末涵體死溶解秘并重及新進(jìn)哭入復(fù)木性途堆徑中抬。帝常采什用高貸濃度襪變性睛劑：副8M督尿素樂、鑒6M部Gu曾C妹翻開蠶各種躺次級(jí)冬鍵，惱以鞠DT央T塌等巰默基試廢劑打益開二險(xiǎn)硫鍵導(dǎo)。嘴能有嘩效促童進(jìn)包窮涵體世溶解揚(yáng)變性貿(mào)的試票劑和趕條件孫包括基：尖促溶述劑項(xiàng)衫雷敗岡最常僑用鋒,限鹽酸圣胍、統(tǒng)尿素仙，前巧者昂抓貴，繩尿素帝廉價(jià)帖，但自常被柄自發(fā)籍形成貫的氰掘酸鹽努污染銅，后佛者能秒與多林肽鏈源中的稿氨基鍛反響柜外表泄活性蓋劑萌新儉SD栗S、幸正十誼二醇掃肌氨聯(lián)酸，蓄廉價(jià)盈，但違影響前復(fù)性腐和純齡化軟混合碎溶劑啟府芝如即尿素差與醋朱酸、修二甲藍(lán)基砜遭等聯(lián)旋合使花用，肆溶解幟力增燥強(qiáng)囑極端初pH授摘僚類廉價(jià)醫(yī)，但詢?cè)S多察蛋白撓質(zhì)在溜極端膝pH年條件座下發(fā)聞生修芒飾反牢應(yīng)連包涵趕體的范復(fù)性域與重揀折疊汪：二泥硫鍵研形成藝〔將問多肽堤鏈中折被拆統(tǒng)開的哨游離歲巰基得氧化互重新卵形成耀二硫胃鍵〔板關(guān)鍵炕〕〕嶄；誰(shuí)通過弓次級(jí)在鍵的蔑形成鈔使蛋卡白質(zhì)姐重折濁疊尾形成留二硫負(fù)鍵的衣方式液主要惠有：冰A砌化學(xué)饒氧化凝法穩(wěn)——袋需要膊電子敞受體總，最胃廉價(jià)危的電事子受拼體為塑空氣厚，二粒硫鍵蛛形成唱是隨捕機(jī)的芽，僅溝適用饅于那后些不泳含游就離半眨胱氨貸酸殘伙基的此蛋白柜質(zhì)的莖重折筒疊胳B卡二硫稱鍵交炒換非——字需要帥復(fù)原吉型和縱氧化葬型谷黑胱甘級(jí)肽〔曲GS縮H和僻GS泰SG給〕，赴二硫潮鍵形膽成相蹲對(duì)特貨異，楚因此雅適用碑性較榆廣，企重折下疊效慨果好銹包涵攤體復(fù)站性操沈作的胸方法第：演緩慢缺降低周變性乖劑濃孩度，央并盡拜量減鄙低蛋氣白濃鹿度。糾詳見怎老師功pp廢t。濟(jì)包涵脅體的雖復(fù)性泉與重謀折疊虛的主煎要挑絮戰(zhàn)是誤：葡李聚集轉(zhuǎn)沉淀塊2、影融合羨型異打源蛋挎白的全表達(dá)翅以融盈合形行式表屬達(dá)目陸的蛋流白的型優(yōu)缺珍點(diǎn)菜①悅目的弱蛋白圈穩(wěn)定蜜性高懼凳尤其巴對(duì)分榆子量耳較小莫的多調(diào)肽效擁果更跡佳胸楚②假目的類蛋白秀易于腰別離返鈴利用因受體豬蛋白笑成熟揀的抗鐵體、記配體賓、底轟物進(jìn)薄行親域和層錯(cuò)析，秧可以紋快速惡獲得競(jìng)純度魯較高優(yōu)的融隔合蛋及白醉預(yù)③斯目的嫁蛋白陵表達(dá)塑率高范飽與受響體蛋埋白共浙用一鹿套完垂善的斜表達(dá)下元件堅(jiān)青④洲目的主蛋白慮溶解暴性好丸舉由于溜受體鋼蛋白棗的存拋在，瑞融合天蛋白奮往往啟能在莊胞內(nèi)覆形成兵良好燥的空秤間構(gòu)脅象，介且大肉多具誕有水紀(jì)溶性末陷⑤催缺點(diǎn)愚：融兆合蛋護(hù)白需湖要裂仰解和唉進(jìn)一穗步分式離，板才能慨獲目鄰的蛋凳白。沉在實(shí)偽際生醋產(chǎn)中猴，產(chǎn)表品主恒要的相本錢傳往往樹就在美該工塞段鴿用于間融合循蛋白報(bào)構(gòu)建繼的T為ag鈔〔5尼種〕閣A揪、H穴is窩6旅鳴易于辛親和相層析宮、不算影響芳目的禽蛋白謊結(jié)構(gòu)尸、無員免疫機(jī)原性柜刃B棋、谷自胱甘評(píng)肽轉(zhuǎn)扒移酶票〔G礦ST蘇〕掘維妻持良爽好空晃間構(gòu)神象三C賊、硫望氧化賄復(fù)原棚蛋白肥〔T敏rx潔A〕剛夾維持吉良好先空間羽構(gòu)象碎母pT搶rx剪Fu湖s醉迎D懲、麥煌芽糖啄結(jié)合解蛋白缺〔M紗BP伐〕釋促供進(jìn)分量泌侮E卷、內(nèi)乘含肽渠〔I賞nt歐ei化n)便：類隙似內(nèi)羽含子炕的多喬肽，榴與目卸的能心蛋白譽(yù)融合依表達(dá)蒜，在后表達(dá)哭后可咳進(jìn)行強(qiáng)自剪市接，壞兼有完蛋白掌酶和飄蛋白落連接半酶的留特性唇。吉4接℃扔、D爹TT慶條件尺下切恥割。煤目的主蛋白丟的回土收頁(yè)⑴兆化學(xué)握裂解螺法-火溴化貼氰〔針CN陷Br條〕法管原理辰：脅CN爪Br霜與M襯et劣的硫大醚基龍反響迫，生暮成高肆絲氨插酸(邪HM速S)迅殘基有留于昌上游踏肽段藍(lán)C端故基因?yàn)巢僮鬏o：在總二個(gè)瓣多肽藥基因書融合寺處設(shè)描置M勺et牢的密客碼子抱⑵黨酶促淚裂解彈法剃原理鄰：利脾用蛋船白酶殲的專豈一性宿識(shí)別狼殘基亮與位料點(diǎn)切獅開融大合肽光基因有操作在：在廣二個(gè)通多肽撐基因頑融合夏處設(shè)呈置蛋渾白酶黨識(shí)別個(gè)殘基俗的密游碼子桌常用規(guī)多殘蠟基識(shí)目別位豈點(diǎn)蛋呈白酶貪Th蝕ro修mb擇in迫(比凝血傲酶〕彎榨麗菌歷伐鍬敞Le識(shí)u-踩Va插l-此Pr暫o-評(píng)Ar您g清▼洗Gl澡y-瓜Se語(yǔ)r裙En柿te批ro繳ki戒na喪se笛〔腸悠激酶沖〕孤蛛撐傅搖畏As跡p-清As藏p-劇As盆p-蜓As優(yōu)p-三Ly狡s鉤▼她Fa賊ct己or栽X饑a所〔壩X獅因子宜〕演吉殖傳乘此療Il銷e-析Gl芳u/貝As浩p-籠Gl怨y-辜Ar喝g上▼嫌Pr替eS村ci福ss磚io縣n堂〔盞5岔℃搶切割管！駱GE泰〕灶親至品Le愛u-挎Gl賴u-廳Va盼l-腹Le啦u-暑Ph現(xiàn)e-覺Gl詞n律▼色Gl名y-棒Pr特o愈TE搏V診pr較ot熔ea辟se踢〔鼓In倉(cāng)vi席tr拍og重en姑)候宿期瓶Gl昏u-殃As勞n-由Le岸u-補(bǔ)Ty鴨r-燃Ph改e-任Gl火n釘▼仍Gl餃y(cè)蜂In校te肚in鑄〔內(nèi)灶含肽唱，自皆切割尺，莊NE幅B繁〕謠婦di岔th授io恨th慨re抽it損ol污c舒le獄av珠ag耳e顯！腫3、凱分泌釘型異犯源蛋刻白的顫表達(dá)缺蛋白是質(zhì)的赴分泌際機(jī)制罷在信當(dāng)號(hào)肽善牽引濃下跨頸膜，汁進(jìn)入糊周質(zhì)久腔；絮B、釣信號(hào)座肽酶暴切下逗信號(hào)尾肽，齊釋放配目的臘蛋白蛾于周溪質(zhì)腔汁。打以分趴泌形逼式表蠻達(dá)目皺的蛋辨白的搖優(yōu)缺冤點(diǎn)糖A、脊分泌評(píng)表達(dá)蒙形式爛的優(yōu)嫌點(diǎn)：阿①督目的蔽蛋白壟以呈郊正確捧折疊吉的可牙溶形覺式存荒在〔俯周質(zhì)秧為氧蔬化型陸環(huán)境要，利媽于二田硫鍵期形成扛〕恢②利目的喘蛋白召穩(wěn)定求性高堂〔周幅質(zhì)腔耀蛋白園酶少裳〕男③寨目的碎蛋白譯末端啞完整緞唉相當(dāng)豈多的過真核脅生物吊成熟狠蛋白增N端青并不攻含有戴的甲剃硫氨蜂酸殘楊基便即可在滾信號(hào)愁肽的更剪切脫過程痛中被金有效年除去映蘭B分慚泌表就達(dá)形卡式的勵(lì)缺點(diǎn)為：燭相對(duì)品其它商生物夠細(xì)胞暈而言有，大超腸桿艘菌的奔蛋白弓分泌幕機(jī)制參并不省健全懇。外裳源真鮮核生仙物基鮮因很鋤難在秘大腸屢桿菌乳中進(jìn)蛋行分腳泌型艘表達(dá)即，少椒數(shù)外消源基吊因即杰便能太分泌到表達(dá)齡，但惠其表盟達(dá)水打平通河常要抗比包墊涵體咽方式何低很川多，斬因此修目前助用于抽產(chǎn)業(yè)昌化的沫異源表蛋白圾分泌遙型重啄組大鋼腸桿噸菌盡授管有閣，但祖并不光普遍蕉。主分要用秩于實(shí)不驗(yàn)室餐小規(guī)萍模制急備。贊4、孩寡聚理型異成源蛋佩白的煌表達(dá)仿以寡艘聚形粘式表哀達(dá)目味的蛋心白的倦優(yōu)缺請(qǐng)點(diǎn)佛穩(wěn)定與表達(dá)法小分貢子短蘇肽研——前短肽刑由于忠缺乏燕有效敬的空晴間結(jié)柔構(gòu)，課易受烤蛋白瘦酶攻檔擊，擠易降析解，傭串聯(lián)緊短肽叨具有柱與蛋圾白質(zhì)喘相似爬的長(zhǎng)飯度及礦空間龍結(jié)構(gòu)怕，可欠抗蛋每白酶霉降解恒。吹②調(diào)目的還蛋白播高效廊表達(dá)畝——贏在不兩提高救質(zhì)粒濤拷貝稠數(shù)的閉前提警下，丸增加看目的政基因青的拷歡貝數(shù)當(dāng)畏③臣目的餅產(chǎn)物陷回收閱困難所四、秘工程竟菌構(gòu)同建、知分析溜、發(fā)朱酵與舅產(chǎn)物帝別離原純化蜜(1脫)癥工程乘菌構(gòu)許建與緒分析延(2辯)框工程豐菌遺附傳穩(wěn)嶺定性沒分析罵滲在非蔥選擇刃條件怕下連凳續(xù)傳饅代數(shù)皇代后頑，對(duì)捷工程窮菌重甚組質(zhì)著粒存小在狀艇況、故結(jié)構(gòu)做完整核性和嗎功能等完整傲性進(jìn)暴行一為下三且項(xiàng)分虹析：敵捷A戴、存主在狀肆況：嫩宏觀姿逃逸跑率商仍B晴、結(jié)耍構(gòu)完蜘整性茂：酶潑切圖隔譜分平析、沿序列巖分析瘋族C捷、功瓣能完適整性辮：表腦達(dá)水裂平顯工程妨菌遺即傳不欄穩(wěn)定淘性的水表現(xiàn)澇形式默分配俱不穩(wěn)虹定性巾〔主傘要〕竹：整滑個(gè)重扮組D片NA的分子京從受劃體細(xì)臨胞中借逃逸廊〔c壽ur究in衛(wèi)g〕谷結(jié)構(gòu)孤不穩(wěn)辦定性何：重貍組D玩NA漂分子宣上某斯一區(qū)聰域發(fā)筍生缺逝失、車重排耐、修羅飾，眾導(dǎo)致?lián)纹浔韰^(qū)觀生剩物學(xué)騙功能囑的喪仇失身重組巡質(zhì)粒息的逃頃逸：每工程哪菌部共分細(xì)壘胞因閱質(zhì)粒軟喪失桂而不隙再攜惹帶重繭組質(zhì)敵粒的麗現(xiàn)象遞。訊重組大質(zhì)粒釘逃逸泰的原伸因圣①落目的頂基因眾本底熱表達(dá)陰產(chǎn)物秧引起驅(qū)的毒攪性反屋應(yīng)絨——均關(guān)閉佩質(zhì)粒搞DN赤A合良成途挺徑，白啟動(dòng)績(jī)降解奧程序潔②蜻目的繡基因臺(tái)高效射表達(dá)怕誘導(dǎo)超宿主灣細(xì)胞赤產(chǎn)生轟應(yīng)激導(dǎo)反響趁狹③欣抗性末標(biāo)記投基因千過表滲達(dá)，濱抗生務(wù)素消舞耗過途快。腸④喉目的船基因躲表達(dá)啞盒吳“代轉(zhuǎn)錄控過頭山〞勺，影升響O咳ri瘦區(qū)域頑。枕⑤☆鄰環(huán)境香因素圖誘導(dǎo)姥的重茅組質(zhì)呼粒滲魂漏誠(chéng)——宣高溫伴、表朵面活復(fù)性劑蠢〔S垂DS訓(xùn)〕、武藥物訪〔利亮福平耐〕、拜染料衛(wèi)〔吖肺啶〕傭重組漸質(zhì)粒砌的宏故觀逃沿逸率癢：獲工程筆菌培集養(yǎng)液憑中丟救失質(zhì)別粒的纏細(xì)胞描占細(xì)包胞總阻數(shù)的舌百分少比。描宏觀稅逃逸紛率〔招%〕烤=〔慮非選撕擇性騰平板甩菌落轉(zhuǎn)數(shù)擴(kuò)—錢選擇役性平辦板菌映落數(shù)告〕豎/非寬選擇筒性平狂板菌醒落數(shù)怒×追10式0哈(3塔)荷發(fā)酵鞋工藝匠研究誕工程絨菌生攜長(zhǎng)與遣表達(dá)蕉主要玩影響限因素胖1、亭培養(yǎng)病基村：怎影響壇菌體訊生長(zhǎng)脊、質(zhì)葬粒穩(wěn)浴定性扶、表垮達(dá)水看平、鍵產(chǎn)物以可溶器性等禮碳源書：道葡萄扛糖、魄甘油泰、乳慘糖、股甘露司糖、任果糖痛等應(yīng)蹈防止痰外源李基因拆表達(dá)惰的暗“萌葡萄銹糖效辣應(yīng)句〞碑。棒氮源史：有鋪機(jī)氮碧：屬酵母活提取付物、旋蛋白支胨、僅酪蛋中白水漲解物矛、玉形米漿算柿停前無機(jī)借氮：饞殼氨水神、硫禿酸銨繞、硝抖酸銨包、氯夠化銨慘等需曾其他浪：無回機(jī)鹽堡、微像量元隱素維擠生素掠、生度物素陳等咐2、吐菌齡橋與接稅種量鄉(xiāng)菌齡如：策自接道種起賄培養(yǎng)廳的時(shí)味間〔酷小時(shí)塵〕庫(kù)附獎(jiǎng)襯影響尊停滯痰期、賓質(zhì)粒瑞宏觀侵逃逸缺率甲接種江量：出是指默接入泳的種妥子液厲體積晃占培半養(yǎng)液解體積抱的百固分比扭坡勞仿騾過小北：延順長(zhǎng)菌漢體停奶滯期翁，質(zhì)發(fā)粒宏信觀逃傭逸率嫁高芒過大拒：菌脫體生甜長(zhǎng)過虛快，壤代謝夢(mèng)產(chǎn)物答積累過過多燃，抑妙制后食期菌責(zé)體的否生長(zhǎng)押，降蜘低表花達(dá)水疊平。筑3、星pH蓋值、類溫度防與溶慘解氧遣液pH衡值：濾影響濫生長(zhǎng)鄭速度跌、表近達(dá)水拒平和徹產(chǎn)物認(rèn)可溶過性。誼生長(zhǎng)灘最適醉pH渴范圍序在交6.袖8-宜7.學(xué)4同，表羨達(dá)最揚(yáng)適丹pH遞為安6.己0-偉6.蠅5氧搖溫度初：跌影響究生長(zhǎng)裹速度誦、表乏達(dá)水弟平和晉產(chǎn)物說可溶藏性。丈生長(zhǎng)疑最適浮37表℃尿，較號(hào)低溫府度利司于可慘溶殺表達(dá)誠(chéng)。豈溶解懼氧：殖影響赤生長(zhǎng)腥速度唯和表誘達(dá)水視平蔽4、吵誘導(dǎo)嚼時(shí)機(jī)鄰與收由菌時(shí)吃機(jī)絞誘導(dǎo)直時(shí)機(jī)壘：給過早真影響播生物掏量、遵過晚虎影響尚表達(dá)怨水平掀。讀一般應(yīng)在生勾長(zhǎng)曲奸線對(duì)弓數(shù)中根期或消對(duì)數(shù)慣后期稠進(jìn)行世誘導(dǎo)奪收菌研時(shí)機(jī)闖：廢過早春影響晨表達(dá)壽水平父、過坐晚影制響產(chǎn)泥物穩(wěn)富定性蛇、可曲溶性覺、并分造成思浪費(fèi)有。一見般在桐表達(dá)床曲線濱平臺(tái)攤期〔落誘導(dǎo)謹(jǐn)后3前-4由小時(shí)軍〕收培菌驕工程陰菌搖劍瓶水晉平生黃長(zhǎng)與幫表達(dá)探試驗(yàn)鄙主要喂研究早參數(shù)弊：培睬養(yǎng)基墳、接畏種量饑、p肢H值迫、溫迅度、誕誘導(dǎo)尼與收隊(duì)菌時(shí)振機(jī)等獵主要燒觀察挽指標(biāo)辨：登表達(dá)融水平孩〔%妻〕、吃生物礎(chǔ)量、塔表達(dá)享產(chǎn)物柴積累逃〔包儀涵體爬形成擦〕情唐況、補(bǔ)質(zhì)粒摩宏觀吃逃逸售率等芬結(jié)果討：生悔長(zhǎng)曲遙線與朵表達(dá)翼曲線突(4笨)篩工程林菌工攏業(yè)發(fā)低酵工叛藝研抄究蛛工程釋菌發(fā)啊酵工潛藝基安本要換求與怠重點(diǎn)壇問題秘：傳根本臂要求塊：把高表血達(dá)、左高生源物量調(diào)、便權(quán)于放醉大、最低成造本燃重點(diǎn)沫問題最：枝1〕糕質(zhì)粒跳穩(wěn)定剛性問蛾題炕2〕宋表達(dá)繩與生熔長(zhǎng)的黑矛盾織問題惹〔誘駛導(dǎo)時(shí)占機(jī)〕盒3〕辱發(fā)酵記方式年問題宅：分航批式祝or處流加朱式發(fā)樓酵？療常規(guī)佳發(fā)酵兆o(hù)r耳高密描度發(fā)肺酵？鎖發(fā)酵街方式肢：館1拉〕批疤式發(fā)飛酵：齊較常船用，鐘高表射達(dá)、他但菌升體量副較少換。瞎2糾〕流衫加發(fā)躍酵：江較常拆用，賺主要蟲補(bǔ)充果碳源其，菌六體量悉大、母表達(dá)場(chǎng)水平刷下降螺，碳概源流穿加時(shí)慨機(jī)和緒速度葵是關(guān)死鍵。乏肝☆狗高密泊度發(fā)鑰酵：筋無機(jī)摟鹽介留質(zhì)，強(qiáng)通過包碳源烤限制域和流盾加實(shí)逗現(xiàn)高妻密度野發(fā)酵移?？?道〕連搞續(xù)發(fā)遺酵：棗少用坐，高綿表達(dá)霞、高融總生柳物量描、難廟控制凈。蓬期工程妨菌工詠業(yè)發(fā)題酵工秒藝流憶程正〔如妄圖所稱示〕嫌：澆(5商)碑表達(dá)蝕產(chǎn)物應(yīng)別離仔純化免工藝木研究迎表達(dá)偏產(chǎn)物馬別離絮純化劃原那么文：葬1〕松要建棗立一妨個(gè)方媽便靈礙敏的御蛋白尸檢測(cè)里方法登，以喪估價(jià)豆每一猴步的呼提純麻程度秀；唉2〕鬧別離串步驟晚要盡錯(cuò)可能江少，流每一候步便仔于工侮業(yè)放他大；摩3〕揚(yáng)盡量機(jī)采用厭柱層者析技鵝術(shù)，嫌各步觸驟間鼠樣品德應(yīng)無菌需復(fù)賠雜處希理；乏4〕迎初步盡別離夜要快驕速、驢大規(guī)性模，龜精純私要高棒分辨管率；海5〕攝盡可古能避倡免帶主入有僚害物輪質(zhì);純6〕磨每步搖需統(tǒng)抵計(jì)：垮得率晉、純康度、滑純化熱倍數(shù)精別離災(zāi)提純氧有三膊步策暖略：菠粗提場(chǎng)、中偵度純躺化、瓶精細(xì)弓純化澆放炸以下左是粗遠(yuǎn)提的富圖示蝦第四臨章粘非腸沃道原悲核細(xì)靠菌基筆因工畜程態(tài)芽孢杜桿菌快基因除工程次1、槐芽孢傷桿菌大表達(dá)經(jīng)系統(tǒng)學(xué)的優(yōu)腐、缺刺點(diǎn)疊優(yōu)點(diǎn)腹：屑1研、強(qiáng)戀大的可分泌月功能鈔：如學(xué)蛋白名酶、我淀粉線酶，游20野g/社L摧幼2芽、不眠形成室包涵貪體，休產(chǎn)物唐可正繪確折濾疊觸3態(tài)、非理病原敲菌，藍(lán)無內(nèi)那毒素爆和外濁毒素轉(zhuǎn)，被痰美國(guó)史FD波A全認(rèn)定祖為紫GR奶AS亭〔總叉體安堅(jiān)全〕繼系統(tǒng)撇脈4送、容攀易操唐作，呼背景吳清楚畢淘5油、易喘于培器養(yǎng)、史生長(zhǎng)脂旺盛在缺點(diǎn)蒸：曉同源幼蛋白凡表達(dá)借高〔衣g/環(huán)L)略、異皇源蛋月白低早(m批g/辦L)括2、馬大腸粒桿菌立與芽獄胞桿忙菌在廚表達(dá)儉外源氏基因坦方面農(nóng)的比起較跪

引大腸君桿菌駕芽胞利桿菌桐模式跑生物殺是旬否怪革蘭獅氏染剃色墾G-饒G+教表達(dá)支產(chǎn)物互的分電泌功馳能翼極少國(guó)大多鄙數(shù)幣包涵盆體組形成救不形渡成播表達(dá)偏水平扁高是對(duì)同壟源蛋愉白高僅，異喜源蛋帳白較遭低帳生物廚平安疤性班高狐高訊別離趨純化越過程蒙復(fù)雜度：復(fù)飽性、詞去內(nèi)擠毒素急簡(jiǎn)單閉糖基相化修戒飾訓(xùn)無疤無1烈3、腔高效弓表達(dá)輩原理鞠1遮〕蓋異源配啟動(dòng)咱子：孤大腸細(xì)桿菌殲系統(tǒng)狠的啟氧動(dòng)子幕結(jié)構(gòu)娘與芽須孢桿閱菌的兵高度租相似頌，異抗源啟楚動(dòng)子市有效假2冷〕從短小傲芽孢朱桿菌阻胞壁國(guó)蛋白載操縱認(rèn)子調(diào)歪控元慎件：致中壁存蛋白悔〔遇MW計(jì)P慨〕和號(hào)外壁鳳蛋白饅基因航組成屠一個(gè)木操縱懂子〔干cw嗚p悟〕，袋由啟輝動(dòng)子喂、魂SD竹序列邪和分傘泌信匙號(hào)肽那么序列訪組成檢的柄5’姻端〔擔(dān)0.端6k哥b)噴序列累可用屯于外嘆源基買因分阻泌表津達(dá)。周調(diào)控吼機(jī)制突：水完整介的胞具壁阻成遏轉(zhuǎn)塘錄，偵生長(zhǎng)俊平臺(tái)股期胞紗壁蛋道白的喜脫落蓋和介車質(zhì)中渡的低襖濃度核的漁Mg羊++叮誘導(dǎo)橋〔去巷阻遏紙〕。干3鴉〕咽利用武枯草中芽孢漁桿菌蜘胞外燈果聚犯糖酶賢操縱岸子調(diào)護(hù)控元混件禾果聚贊糖酶旋操縱饅子〔光sa就cB媽〕由版啟動(dòng)內(nèi)子障Ps蹲ac喇B藝、上傲游正屢調(diào)控旋序列論De聲gQ聞和封Sa菜cU范、果嫁聚糖飯酶基桑因穩(wěn)(s疊ac鎮(zhèn)X)敬、下喂游終潛止子伯樣序報(bào)列和菜抗終伙止蛋班白君Sa召cY撫基因縱組成潤(rùn)。擔(dān)第五孩章飽真箱菌疫基因副工程捆一、長(zhǎng)真菌明表達(dá)街系統(tǒng)己的優(yōu)報(bào)缺點(diǎn)檢具有們?cè)搜老到y(tǒng)粒的操禿作簡(jiǎn)慶便、勺分子乓生物長(zhǎng)學(xué)背戴景清末楚的溪優(yōu)點(diǎn)莖，暴具有持真核紀(jì)系統(tǒng)蛛蛋白倡翻譯話后加離工和道分泌繪系統(tǒng)酷大規(guī)攀模發(fā)里酵歷饅史悠濃久、淘技術(shù)棋成熟甲、工蛋藝簡(jiǎn)法單、堪本錢勸低廉返不含始有特袍異性轟的病售毒、繞不產(chǎn)裳內(nèi)毒霞素，廈為G折AR紗S系匠統(tǒng)君缺點(diǎn)青：產(chǎn)腥物糖剖基化鬼位點(diǎn)敵和結(jié)牛構(gòu)特端點(diǎn)與輕高等摘真核惠的有苗差距饑二、此釀酒序酵母竹載體花系統(tǒng)徐1、片野生攪型質(zhì)刺粒：賴2脫μ紛質(zhì)?？贰册勍平驼`母〕痛2、篇人工追構(gòu)建娛質(zhì)粒忠:鹿5種見猜土筐酵母培附加惜型質(zhì)勺?！膊薡E茫p〕蠻會(huì)酵賴母復(fù)網(wǎng)制型劍質(zhì)粒塌〔Y儉Rp酬〕豎虜股毅酵母塵著絲跨粒質(zhì)性粒〔廉YC菠p)捎裳喚酵母念人工主染色振體〔尋YA遷C〕勤仰證捷酵母撞整合漿型質(zhì)限?！擦鱕I岸p〕紗3、瘡標(biāo)記擁：營(yíng)口養(yǎng)缺健陷型芳的互失補(bǔ)基原因/擺抗性內(nèi)基因匪宿主類細(xì)胞漂：為飲氨基獄酸或麥核苷卷酸生張物合轟成缺帶陷型壩突變底子，健主要盒有：駁LE櫻U-密、燕TR柿P-辣、膏HI糧S-品、脖UR飽A-盡載體杏：攜紋帶相誘應(yīng)的技合成恨基因嶄，如鉤：盛le科u1婚/l鑼eu淋2、墨tr且p1揮、h街is零3/悲hi襪s4峰、凝ur正a3礙選擇撥壓力霉：不雁完全母培養(yǎng)喊基，紋如：弊YN瞇B、島無機(jī)葛鹽培睬養(yǎng)基號(hào)4、箭酵母附菌轉(zhuǎn)塌化方暴法是A、型原生穿質(zhì)體系轉(zhuǎn)化矩法：償細(xì)胞輛：去銹壁的速原生捕質(zhì)體練原理僚：以瞞PE窩G等辛滲緩灰沖液滿穩(wěn)定偽原生亭質(zhì)體傻，以毫Ca棵2+濕誘導(dǎo)利細(xì)胞磨攝取領(lǐng)外源鹿DN蛛A。貝特點(diǎn)心：3機(jī)0%壺以上河為多漿質(zhì)?；旃厕D(zhuǎn)翁化致轉(zhuǎn)化傭效率邁：可原達(dá)原遭生質(zhì)墊體總房數(shù)的吉1-創(chuàng)2%切，但厲操作器周期書長(zhǎng)，斧而且躁轉(zhuǎn)化逐效率均受到塑原生接質(zhì)再戒生率閘的嚴(yán)隨重制黃約。變B、央堿金踏屬離交子介乒導(dǎo)轉(zhuǎn)涼化法亮：光細(xì)胞墳：帶顆壁的慮完整休細(xì)胞糧原理面：通撫過堿壓金屬糟離子饒〔如都Li頓+等典〕、醋PE腿G和柿熱休灶克處竊理誘球?qū)Ъ?xì)希胞吸糞收外理源D范NA支。斧特點(diǎn)桐：方踐法簡(jiǎn)基便，般容易列掌握籃，實(shí)致用性境強(qiáng)；浙吸收透線型族DN硬A的早能力微明顯肆大于六環(huán)狀耐DN塊A，恩兩者胞相差住80做倍；炮共轉(zhuǎn)頑化現(xiàn)鍵象極價(jià)為罕姓見。脹C、支電激爐轉(zhuǎn)化趕法：遲細(xì)胞奶：帶薦壁完賴整細(xì)移胞或垃原生棟質(zhì)體欲原理參：通啦過電食脈沖濾對(duì)細(xì)限胞膜更造成域DN中A攝定取通既道斃特點(diǎn)帥：轉(zhuǎn)階化率防高〔漫10罩5存/館m蛾g私DN云A〕繭、操即作簡(jiǎn)眉便、絨適用亭范圍吼廣倆5、立用作環(huán)外源艙基因杰表達(dá)應(yīng)的酵各母宿前主菌富釀酒位酵母木：最福成熟就的真脈核細(xì)網(wǎng)胞表屬達(dá)系醋統(tǒng)，跟表達(dá)宏水平殖低，防產(chǎn)物滾過度初糖基絡(luò)化觀甲醇拿酵母脹：可歲以利澆用甲凝醇作阿唯一輪碳源午，表咱達(dá)水句平高濟(jì)，產(chǎn)宗物糖振基化楊更合諷理萌畢赤吹酵母基：巴兇斯德乎畢赤鼻酵母禿〔P挎ic丘hi丑a老pa喬st族or憶is相〕查漢遜幅酵母奮：多紋型漢罰遜酵編母〔賴Ha筑ns耐en稿ul培a混po狐ly嚇mo持rp嘉ha泉〕伐其它權(quán)酵母嚇：已頁(yè)有6袋0多禮種酵溝母菌騙建立和了轉(zhuǎn)努化系叛統(tǒng)迷笑乳圍酸克凡魯維售酵母賠〔K批lu富yv罩er爸om姿yc席es地l嘉ac朽ti喚s)進(jìn)非每洲酒雨裂殖猶酵母叢〔S搜ch查iz豆os盯ac嶄ch倍ar虹om積yc處es轉(zhuǎn)p春om土be鐵)睬6、慘釀酒哀酵母質(zhì)糖基研化系腎統(tǒng)制糖基哈化位吵點(diǎn)干：宮As算n-咸X-替Th己r/敢Se黨r〔登X憂代表貢任何白氨基斜酸濕〕央棄洗N-蘇型糖詢基化止：池天門評(píng)冬酰猛氨酸棟殘基粗上的艘酰胺鵝氮進(jìn)粒行糖呆基化遍，糠對(duì)蛋桿白質(zhì)燥的折堡疊、皂穩(wěn)定援性及扮活性膛較重暮要。障捕包O-洗型糖陡基化研：印蘇氨輸酸/床絲氨秘酸上晨的羥兄基氧伸進(jìn)行氣糖基收化旺三、小甲醇尿酵母鞠表達(dá)主系統(tǒng)守1、追甲醇犁酵母齡與甲熟醇氧芹化酶沙啟動(dòng)曲子：猛指可董利用撲甲醇掘作單精一碳細(xì)源的教一類撐酵母甚，如予：畢啦赤酵稍母、點(diǎn)漢您森酵蛙母、馳假絲弓酵母惱甲醇?xì)炑趸裁竼⑹绖?dòng)子僚：前A、疑目前貫已發(fā)豪現(xiàn)的冷、最欲強(qiáng)的膠真核蠅啟嗎B、詳嚴(yán)謹(jǐn)折調(diào)控縫型啟解動(dòng)子筆：早肥A敬OX門1：愉甲醇季誘導(dǎo)朽，葡侵萄糖澤阻遏慮，甘刑油脫葬阻遏乞謹(jǐn)M密OX獄：甲亭醇誘辜導(dǎo)，糕葡萄衣糖阻祖遏、洪甘油診脫阻牲遏坦2、飽甲醇潔酵母許表達(dá)惱系統(tǒng)平的優(yōu)倘缺點(diǎn)殼A、搶表達(dá)攔水平節(jié)高〔悉最高班水平薦的系情統(tǒng)〕世B、乞產(chǎn)物蜜可翻信譯后鍬修飾惱：糖滲基化榜、磷致酸化駱、酰肉脂化械C、疲過糖欄基化俯程度雞比釀齊酒酵栗母少姐〔8賞-1栗5個(gè)走vs元10座0-譽(yù)15珍0個(gè)僚甘露鏟糖〕戰(zhàn)D、偉產(chǎn)物溉可正暮確折題疊和脆高效蛋分泌稼〔最投高分咸泌表捏達(dá)系舞統(tǒng)〕攜E、輛可利貌用簡(jiǎn)神單無紡機(jī)鹽狗培養(yǎng)堵基高威密度闖發(fā)酵慮，生捐物量械大。沒F、受實(shí)驗(yàn)絞室和暑工業(yè)孟操作竟簡(jiǎn)單緩G、誤不能稈滿足逝結(jié)構(gòu)蘇要求濫嚴(yán)格沈的糖識(shí)基化扛3、巴甲醇污酵母偏二大聰宿主銹系統(tǒng)企主要驚特點(diǎn)砌工程栽碗覺爹捎打僵洲畢赤咬酵母賊督躁因招功寨疏爆翼鼓漢遜鳥酵母圖最適察溫度侮恥號(hào)捆抗國(guó)3赴0朋℃捎寨攔債喇餅弄桌很殼膜秤席芬37籍℃無最適撫pH碑值智味裂陡番屬4及.5楊忠綠搖高眉講拳令質(zhì)剪馳4走.5形甘油犬阻遏鋒央黃擊圓零奶是均綿衛(wèi)犁呀梢象詢金瓣料關(guān)燈并科否痛糖基訴化穗諸岡春釘架冠歪局部碧過度訪男闖下侮壓當(dāng)確潔驚貨較正奮常勸高密淚度發(fā)歡酵木彎溫唯淡10絞0g橋/L貍緣里腸慨邀喬接滴姿喂買貼10絹0g英/L孔歸選擇冒標(biāo)記努竊攀hi核s4盯、立G4帶18黑、炕Z紡eo條ci臭n敲、牛Cu給++呆咬副貌le悟u2民、防h萄is說3倉(cāng)、拋ur羅a3裁、烘G幫41胖8盤4、雅畢赤蛋酵母輝系統(tǒng)摔表達(dá)快載體央與整窮合模師式氏5、槳多拷算貝整姿合重澇組子孩篩選曠必要兼性：霉盲淺目的惑基因恭表達(dá)準(zhǔn)盒的觸多拷吸貝整娃合是研高效膨表達(dá)傭的基者礎(chǔ)，謠但多切拷貝陣整合硬是低棉概率龜事件螺〔1瞞-1翅0%芹〕慣G4頸18晝抗性道篩選各：驕這表珍達(dá)載辰體引霉入卡匆拉霉清素基忍因〔高Ka闊na旅my絮ci轟n〕辭作二婚級(jí)篩炊選標(biāo)企記，抬從H蔥is洪4+破轉(zhuǎn)化擠子中鳳篩選印高G旺41良8抗買性轉(zhuǎn)擔(dān)化子栗，抗?fàn)t性越典高整農(nóng)合拷鴉貝數(shù)養(yǎng)越高間。訂雜交膽篩選妻：菌納落原織位或汪Do駐t-捐Bl絨ot嶼ti汁ng棕雜交掌篩選喊莊6、刻Hi蹦s+暢轉(zhuǎn)化金子甲鬼醇表京型篩甜選簽必要搜性：悔A矛、不或同目討的基換因的冶表達(dá)提偏愛爛不同墾甲醇倡表型茅B、寶工程勸菌表巷達(dá)誘汗導(dǎo)條謝件的馬優(yōu)化卻需要攀依據(jù)商甲醇暑表型纖C、對(duì)限切聰酶線鋤性化怨方式岸誘導(dǎo)言靶向閘整合鏡〔下伶表〕臭，但逝即使遞非A責(zé)OX撒1取招代型嚼整合狀方式舍，也捐有可麗能因各同源倡重組傷而破溝壞A目OX搖1基繭因，雀產(chǎn)生尤Mu吧tS朽表型咱。永線性出化位錦點(diǎn)棉〔限牌切位夠點(diǎn)〕錄整合替事件貍〔位影點(diǎn)〕艙GS傻11揮5株嘩〔A任OX棵1野榜生〕熔KM準(zhǔn)71齊株梢〔A炮OX績(jī)1缺蕩失〕后Sa策l塌I踐or守S仇tu悟I范插入損，眉hi癥s4智Hi答s+虎Mu驗(yàn)t+隔Hi錯(cuò)s+絞Mu轉(zhuǎn)ts谷Sa姐c絲I小插入麻，永5’債AO涼X1賓Hi仍s+緩Mu鬧t+本Hi學(xué)s+惡Mu考ts析No鵝t牽I塵or匪顏Bg斃l斯II短取代它，橋AO勻X1捉Hi偵s+沈Mu和ts被埋Hi閘s+魚Mu余t+沸Ar摔g-誤7、牙轉(zhuǎn)化唐子P公CR走鑒定像必要炎性：盾擾證咽明外蠶源基科因確多實(shí)整改合在文宿主燥基因敘組D障NA推，并務(wù)排除圣意外鞏喪失興目的蠶基因疼〔機(jī)涉理不彈明〕統(tǒng)的多Hi盒s+咬表型恭轉(zhuǎn)化伯子。仔PC可R鑒斗定：尺以G蠟S1巷15呀的H粗is叛+轉(zhuǎn)夫化子額為例趟模盤板：徐轉(zhuǎn)化旁子基怖因組叨DN煤A答引租物：介Pr引im好er旋拐5煌’共：來康自烈5懇’狠AO工X1么；P塔ri銀me閃r重3片’頁(yè)：T至T〔潔3漢’于AO猴X1倒〕圓產(chǎn)念物：怎a.酬目的俊基因腫〔A楚OX候1缺搜失，費(fèi)Mu悄ts疲型塞轉(zhuǎn)化鐵子〕艙錯(cuò)航魯b順.目縫的基街因+學(xué)完整肺AO仗X1巴基因沒〔M奔ut御+型影轉(zhuǎn)化紀(jì)子〕攜高密灰度發(fā)迷酵工拌藝流酷程與隊(duì)碳源嫩操作種子液制備種子液制備根底培養(yǎng)甘油流加期甲醇流加期收罐〔固液別離〕BMGY，至對(duì)數(shù)期，16-24hr，OD600=2-64%甘油+無機(jī)鹽培養(yǎng)基，至甘油耗盡，18-24hr以50%甘油限制性流加，增加細(xì)胞密度，4hr，180-220g/L以100%甲醇限制性流加，誘導(dǎo)表達(dá)，增加細(xì)胞密度，48-68hr，350-450g/L揚(yáng)第六邁章備昆瓣蟲基華因工拴程發(fā)1、窮DN剪A轉(zhuǎn)里座子脫的類殺型窮插入妄序列的(I饑S)甘：且巴最簡(jiǎn)捉單的鏈轉(zhuǎn)座驕子稱騎為插澡入序蹲列(趟In六se懼rt奧io卸n抖se悉qu姥en屠ce甜，I彼S)植。獨(dú)IS灑家族逮有很朗多成白員，郵它們作的結(jié)蕉構(gòu)相袖似耐特征拔：右兩端鐮都有企短5效-9煎bp悲的正妥向重里復(fù)序右列〔堆di未re肅ct握r查ep進(jìn)ea追ts苗,哀DR矮〕〔咬靶序?qū)W列〕診，略另長(zhǎng)1脫5-呈25箱bp期的反催向重砍復(fù)序?yàn)⒘小膊舏n掩ve從rt扯ed掉r懇ep蜻ea鉗ts幟,休IR郊〕1月kb訊左右菠的編貝碼區(qū)兼，它阻僅編晃碼和敗轉(zhuǎn)座際有關(guān)嚴(yán)的轉(zhuǎn)曠座酶處。島復(fù)合蔽轉(zhuǎn)座餓子〔稅co鉆mp雞os淺it賣e猴t胃ra愉ns桶po時(shí)so宜n〕慚復(fù)合凱轉(zhuǎn)座欠子是亭由兩旺個(gè)重犧復(fù)序伯列夾東著一屠個(gè)或已多個(gè)細(xì)結(jié)構(gòu)逢基因餡如某請(qǐng)些抗槳藥性島基因殃和其刃它基匆因組塊成。斥存在壘于R蚊因子擊及其避它質(zhì)倘粒中投。復(fù)柱合轉(zhuǎn)押座子借兩端徐的組項(xiàng)件由報(bào)IS厘和類詢IS飯組成隔。蜻2、遺DN竄A轉(zhuǎn)蜂座的絮一般爛模式哥轉(zhuǎn)座餃可被惜分為賭復(fù)制狀性和窗非復(fù)勤制性倘兩大否類。村在鑒復(fù)制我性景轉(zhuǎn)座翻中，船所移胃動(dòng)和累轉(zhuǎn)位柏的是布原轉(zhuǎn)弱座子繪的拷山貝。拒轉(zhuǎn)座舌酶〔暫tr鄙an介sp廟os些as被e〕莊和解搶離酶依〔r絞es智ol辰va己se殘〕分佛別作缺用于階原始里轉(zhuǎn)座蓬子和鐵復(fù)制山轉(zhuǎn)座套子。湊Tn逮A類資轉(zhuǎn)座捉主要鋒是這數(shù)種形渾式。彈在鎖非復(fù)濟(jì)制性姜轉(zhuǎn)座堆中，摸原始店轉(zhuǎn)座摸子作喉為一藍(lán)個(gè)可崖移動(dòng)園的實(shí)抗體直至接被悠移位揀，I技S序橡列、慢Mu班及T傭n5僑等都烈以這個(gè)種方什式進(jìn)驗(yàn)行轉(zhuǎn)漏座。替3、傲果蠅蝕轉(zhuǎn)座恢元件鉛Co功pi料a解反轉(zhuǎn)學(xué)座子應(yīng)；貝FB昆陶家族臉；縮★轟P考元件禍P威因子薯P因代子全池長(zhǎng)2圾9鳳07盤b傾p，逼兩端顯有3彎1b顫p的嘆反向慌重復(fù)刃序列茫。4滴個(gè)編忘碼區(qū)蝦、3禿個(gè)內(nèi)栽含子蓋。椒體細(xì)侍胞錄中，凳只有較內(nèi)含爺子1遇、2香被順駱利切富除，驗(yàn)產(chǎn)生資前3讓個(gè)外擇顯子調(diào)的功然能型洗m貝RN忘A，興被翻撲譯成辜66刊KD平的轉(zhuǎn)棉座阻滲遏蛋靠白脹——恭一種娘轉(zhuǎn)座微活性誘的抑怖制因攪子。涉生殖竄細(xì)胞朱中，裂內(nèi)含辱子3另被切加除，氏產(chǎn)