血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶速率法測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書

血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶速率法測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書實(shí)驗(yàn)原理VitrosAST試劑是一種干燥，多涂層的，在聚合物支撐基片上涂有分析成份的化學(xué)干片。將一滴患者樣品滴于干片上，樣品就被分布層均勻地分布并滲透到下面的試劑層。在磷酸吡哆醛的催化作用下，谷草轉(zhuǎn)氨酶使天門冬氨酸的氨基向α-酮戊二酸轉(zhuǎn)移生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸在草酰乙酸脫羥酶的作用下生成丙酮酸和二氧化碳。隨后丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化生成乙酰磷酸酶和過(guò)氧化氫。最后是過(guò)氧化氫與白色染劑在過(guò)氧化物酶的催化下生成一種有色染劑。在37℃用反射儀可以測(cè)定白色染劑的氧化率，然后再將某一線性范圍內(nèi)反射強(qiáng)度變化率轉(zhuǎn)化為以U/L為單位的酶活性度。干片支撐層上的短波濾光劑可以減少入射光在有色染劑形成過(guò)程中的影響。測(cè)定方式：速率法波長(zhǎng)：670nm測(cè)試時(shí)間和溫度：37℃約５分鐘反應(yīng)過(guò)程：AST，磷酸吡哆醛天門冬氨酸+α-酮戊二酸————————→草酰乙酸+谷氨酸草酰乙酸脫羥酶草酰乙酸————————→丙酮酸+二氧化碳丙酮酸氧化酶丙酮酸+磷酸鹽+O2————————→過(guò)氧化氫+乙酰磷酸酶過(guò)氧化物酶過(guò)氧化氫+白色染劑————————→有色染劑2.標(biāo)本：2.1病人準(zhǔn)備：無(wú)特殊。2.2樣品類型：血清；肝素鋰/鈉抗凝血漿。2.3標(biāo)本采集與處理：樣品采集后3天內(nèi)以1000g最少離心10分鐘，然后吸出血清。特別要注意：樣品不能含細(xì)胞物質(zhì)，因?yàn)檠“逯蠥ST活性也很高，既使離心不足10分鐘的新鮮血漿與新鮮血清的測(cè)試結(jié)果相比都有很大差異。處理樣品時(shí)要將其當(dāng)成生物污染品。3.標(biāo)本的存放：血清、血漿室溫下最多3天；4～8℃冷藏最多1周；樣品冷凍保存可達(dá)3個(gè)月。4.標(biāo)本的運(yùn)輸：樣品要放在帶蓋的容器內(nèi)以防污染和蒸發(fā)。5.標(biāo)本拒收的標(biāo)準(zhǔn)：由于用草酸鉀/氟化鈉，枸掾酸和EDTA抗凝的標(biāo)本結(jié)果負(fù)偏差>50%，因此不能使用。此外，因?yàn)榧t細(xì)胞中AST活性很高，溶血標(biāo)本也不能使用。6.試驗(yàn)材料：6.1測(cè)試AST所需的物品包括：Vitros化學(xué)定標(biāo)物Kit3；Vitros特制質(zhì)控液；Vitros7%BSA稀釋液。xx廠家提供原裝進(jìn)口，試劑盒外包裝上標(biāo)明了測(cè)試項(xiàng)目名稱，試劑標(biāo)簽代碼，有效期限和儲(chǔ)藏溫度。6.1.1試劑組成：干片成分：反應(yīng)成份是天門冬氨酸鈉；α－酮戊二酸鈉；磷酸吡哆醛鈉；磷酸鈉；2－（3,5－二氧甲基－4－羥苯）－4,5－二（4－甲氨基）咪唑（白色染料）；氧化丙酮酸；過(guò)氧化物酶以及草酰乙酸脫羥酶。其它成份有酶輔助因子，染色劑，粘合劑，緩沖劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，染料溶劑，濾色劑，凈化劑及聚合物交叉連接劑。干片標(biāo)記：試劑盒外包裝上標(biāo)明了測(cè)試項(xiàng)目名稱，試劑標(biāo)簽代碼，有效期限和儲(chǔ)藏溫度。6.1.2試劑準(zhǔn)備：從冰箱中取出干片盒，在將干片盒打開封裝并裝入儀器內(nèi)的干片儲(chǔ)藏器之前必須使其達(dá)到室溫狀態(tài)18～28℃。因此從冰箱中取出的試劑盒至少要在室溫下要放置60分鐘，而冷藏的試劑盒至少要在室溫下放置30分鐘。去除內(nèi)包裝后立即將干片盒放入儀器的儲(chǔ)藏器中。說(shuō)明：在試劑盒達(dá)到室溫后的24小時(shí)之內(nèi)必須將其裝入儀器中。6.1.3試劑穩(wěn)定性與貯存未開封的干片盒：存儲(chǔ)在-18℃或低于該范圍。說(shuō)明：為了縮短預(yù)溫時(shí)間或者當(dāng)冷凍空間有限時(shí)，未開封的試劑盒在2～8℃（36～46oF）下最多可以冷藏三個(gè)月。在機(jī)內(nèi)干片儲(chǔ)藏器中的干片盒：在儀器上放置時(shí)間不能超過(guò)2周，否則要更換新試劑。當(dāng)儀器關(guān)閉時(shí)間不超過(guò)2個(gè)小時(shí)時(shí)，可將干片盒留在儲(chǔ)藏器中。出現(xiàn)以下情形要做質(zhì)控檢測(cè)：儀器關(guān)閉時(shí)間超過(guò)2小時(shí)；再次裝載從儀器儲(chǔ)藏器中取出的干片盒。如果儲(chǔ)藏正確，VitrosAST干片可保質(zhì)到包裝盒上標(biāo)明的有效期限。參見(jiàn)VITROS250干化學(xué)分析儀試劑穩(wěn)定性及貯存.SOP文件。6.1.4變質(zhì)指示：超過(guò)有效期的試劑干片不能使用。6.1.5注意事項(xiàng)：為避免干片盒打開以前其內(nèi)包裝受損，不能摔打干片盒；不要讓尖利物刺入內(nèi)包裝。6.2校準(zhǔn)品：用Vitros化學(xué)定標(biāo)物Kit3。血清、血漿都用相同的定標(biāo)液，不過(guò)各自的SAVs值不同。有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)液的配制，使用及保存的配制，保存和穩(wěn)定的詳情，可參閱VITROS250干化學(xué)分析儀校準(zhǔn)品和質(zhì)控品.SOP文件。6.3質(zhì)控品：使用Vitros特制的質(zhì)控物品；若使用其它的一些質(zhì)控物品，當(dāng)與別的AST測(cè)試方法比較時(shí)就會(huì)出現(xiàn)差異，如：用人血清/血漿混合物分離制成的質(zhì)控物品；含有高濃度防腐劑，穩(wěn)定劑和其它化學(xué)添加劑的質(zhì)控物品；豬或牛血清質(zhì)控品的淀粉酶值會(huì)偏低，還會(huì)因測(cè)試方法不同而變化；酶的活性可能會(huì)由于酶源，稀釋溫度和復(fù)溶活化時(shí)間的不同而發(fā)生變化；乙烯乙二醇作穩(wěn)定劑的質(zhì)控物品不能使用。有關(guān)質(zhì)控液的配制，保存和穩(wěn)定的詳情，可參閱VITROS250干化學(xué)分析儀校準(zhǔn)品和質(zhì)控品.SOP文件。7.儀器美國(guó)xx廠家VITROS250全自動(dòng)干式生化分析儀。具體測(cè)試程序請(qǐng)參閱操作手冊(cè)的介紹。8.操作步驟：將試劑復(fù)溫后直接放入儀器，樣品編程，儀器5分后自動(dòng)打印結(jié)果。具體測(cè)試程序請(qǐng)參閱VITROS250操作手冊(cè).SOP。具體定標(biāo)程序：參閱操作手冊(cè)的相關(guān)章節(jié)內(nèi)容。何時(shí)進(jìn)行定標(biāo)：——在維護(hù)和保養(yǎng)時(shí)更換了儀器的重要部件。——質(zhì)控結(jié)果持續(xù)超出線性范圍內(nèi)時(shí)，詳情參閱操作手冊(cè)?！芾?xiàng)l例上指定的時(shí)間，在美國(guó)，CLIA要求至少每6個(gè)月定標(biāo)一次。9.檢驗(yàn)結(jié)果的判斷與分析10.質(zhì)量控制操作建議：將質(zhì)控物質(zhì)當(dāng)成生物污染品來(lái)處理；將質(zhì)控液與患者樣品同時(shí)進(jìn)行測(cè)試；每天至少做一次質(zhì)控以檢測(cè)儀器運(yùn)行狀況；選擇質(zhì)控濃度來(lái)檢查與臨床的相關(guān)性；其它詳情參閱操作手冊(cè)質(zhì)控章節(jié)的有關(guān)內(nèi)容。有關(guān)質(zhì)控操作的常規(guī)性條例可參照國(guó)際質(zhì)控檢測(cè)（IQCT）的內(nèi)容。在每一批標(biāo)本中都應(yīng)把質(zhì)控血清做為未知標(biāo)本進(jìn)行分析，以2S為質(zhì)控警告限，3S為失控限，繪制質(zhì)控圖，判斷是否在控。質(zhì)控規(guī)則參見(jiàn)生化室室內(nèi)質(zhì)控操作規(guī)程.SOP文件。11.計(jì)算方法：以用Vitros化學(xué)定標(biāo)物校準(zhǔn)儀器后，在病人結(jié)果可報(bào)告范圍內(nèi)，儀器直接報(bào)告可靠的檢測(cè)結(jié)果，以U/L報(bào)告。12.參考值范圍國(guó)際單位(U/L)成人15-46女性14-36男性17-59此參考范圍是測(cè)試189位健康成人，然后取靶值附近95%的結(jié)果計(jì)算所得。參考值因性別、年齡、飲食和地域的不同而有所差別。根據(jù)好的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考值。13.臨床意義谷草轉(zhuǎn)氨酶在人體的心臟，骨骼肌和肝臟中活性較高。心肌梗塞，肺栓塞，骨骼肌創(chuàng)傷，酒精性肝硬化，病毒性肝炎和藥物引發(fā)的肝炎多造成血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性上升。14.操作性能14.1線性范圍血清/尿液：3.0-750U/L。14.2精密度：在Vitros250生化儀上用質(zhì)控液來(lái)測(cè)精密度。結(jié)果反映了該方法的精密度。當(dāng)儀器維護(hù)，周圍環(huán)境，干片處理和保存，質(zhì)控液的復(fù)溶以及樣品處理等方面發(fā)生變化都會(huì)影響結(jié)果的重復(fù)性。日間精密度血清(U/L)s(U/L)CV(%)室間精密度n=31天(U/L)s(U/L)CV(%)樣品1n=238290.5樣品1290.72.4樣品2n=2342543.1樣品22544.31.7樣品3n=23682727.9樣品382728.83.5*日間精密度是將2至3份相同的樣品在一天中運(yùn)行兩次，然后對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。**室間精密度是用同一個(gè)批號(hào)的干片每周定標(biāo)一次，然后對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。14.3方法學(xué)比較：用Vitros700儀器和IFCC參考方法分別測(cè)試相同血清樣品，對(duì)比結(jié)果顯示Vitros方法的準(zhǔn)確度良好。用Vitros250儀器與Vitros700儀器測(cè)試相同的血清樣品，對(duì)比結(jié)果顯示Vitros250方法的準(zhǔn)確度良好，血清：Y=1.03X-6.54（r=0.999，N=60，檢測(cè)范圍15-644U/L）。14.4靈敏度：本試劑的檢測(cè)下限為血清為3U/L。14.5特異性：經(jīng)測(cè)試，以下物質(zhì)對(duì)VitrosAST干片法均無(wú)干擾（偏差<5.4U/L）。乙酰乙酸20mg/dl、撲熱息痛20mg/dL、丙酮60mg/dL、阿司匹林35mg/dL、阿昔洛韋10mg/dL、硫酸舒喘寧1.84ug/mL、別嘌醇5mg/dL、三唑安定0.02mg/dL、硫酸阿米卡星40mg/dL、兩性霉素B3.5mg/dL、氨卞青霉素200mg/dL、鹽酸阿米替林2.5ug/mL、抗壞血酸鹽6mg/dL、硫唑嘌呤1mg/dL、疊氮胸苷30mg/dL、未結(jié)合膽紅素20mg/dL、咖啡因35mg/dL、卡托普利2mg/dL、卡馬西平12mg/dL、頭孢唑啉400mg/dL、頭孢曲松250mg/dL、氯霉素25mg/dL、利眠寧2mg/dL、鹽酸普魯卡因10ug/dL、膽固醇340mg/dL、西咪替丁10mg/dL、克林霉素20mg/dL、可樂(lè)定0.2ug/mL、可待因1.7mg/dL、可的素0.23mg/dL、環(huán)孢菌素4ug/mL、地塞米松1.35ug/mL、安定2mg/dL、地高辛4ug/mL、地爾硫卓0.2mg/dL、苯海拉明7mg/dL、安乃近50mg/dL、多巴胺3ug/mL、紅霉素20mg/dL、乙醇394mg/dL、氟安定15mg/dL、呋塞米10mg/dL、焦硫酸鹽50mg/dL、慶大霉素12mg/dL、龍膽酸25mg/dL等等。14.6病人結(jié)果可報(bào)告范圍：血清3-750U/L。15.超出范圍結(jié)果處理：本法線性上限為血清750U/L。如果樣品中AST濃度超出系統(tǒng)的測(cè)試線性范圍，請(qǐng)按下列步驟進(jìn)行稀釋：用7%BSA稀釋樣品；重新測(cè)試；將測(cè)試結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，就得到原始樣品中AST的活性；如果樣品中AST的活性仍然超出系統(tǒng)的線性范圍，加大稀釋倍數(shù)，重新測(cè)試，然后將測(cè)試結(jié)果乘以新的稀釋倍數(shù)。16.病危報(bào)警值的處理17.方法局限性17.1本法線性上限為血清750U/L。如果樣品中AST濃度超出系統(tǒng)的測(cè)試線性范圍，請(qǐng)按下列步驟進(jìn)行稀釋：用7%BSA稀釋樣品；重新測(cè)試；將測(cè)試結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，就得到原始樣品中AST的活性；如果樣品中AST的活性仍然超出系統(tǒng)的線性范圍，加大稀釋倍數(shù)，重新測(cè)試，然后將測(cè)試結(jié)果乘以新的稀釋倍數(shù)。17.2干擾物質(zhì)：我們對(duì)VitrosAST方法的干擾物質(zhì)進(jìn)行了篩查,下列物質(zhì)在表中所示濃度會(huì)引起一定的結(jié)果偏差。在妥拉磺脲濃度為40mg/dL