第六章基因工程的基本技術(shù)演示文稿

第六章基因工程的基本技術(shù)演示文稿本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分優(yōu)選第六章基因工程的基本技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分核酸提取技術(shù)凝膠電泳技術(shù)PCR技術(shù)核酸雜交技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)主要內(nèi)容本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分第一節(jié)、第二節(jié)前章節(jié)已介紹本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分第三節(jié)PCR技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分第三節(jié)PCR技術(shù)PCR基本原理基本過程與反應(yīng)體系PCR引物設(shè)計(jì)的原則PCR產(chǎn)物質(zhì)量的影響因素PCR的種類本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分中文名稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1、PCR原理：

變性溫度下，DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。技術(shù)3：PCR技術(shù)(polymerasechainreaction)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分PCR操作流程94℃50℃72℃本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分2、

PCR反應(yīng)過程：變性：DNA雙鏈變?yōu)閱捂?；退火：引物與模板結(jié)合；延伸：合成互補(bǔ)鏈；上述過程通過PCR儀的程序設(shè)計(jì)及自動(dòng)運(yùn)作完成。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分3、PCR反應(yīng)體系：體系成分：模板DNA、引物、Taq酶(熱穩(wěn)定性)、dNTP、反應(yīng)緩沖液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）

。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分1）、引物（寡聚核苷酸）一般成對(duì)出現(xiàn)，長(zhǎng)度為15-30個(gè)核苷酸；

使用濃度：，高達(dá)1uM；引物設(shè)計(jì)原則：G+C含量45-55%；Tm值高于55；引物特異性；引物擴(kuò)增跨度；是否形成引物二聚體引物的3’端嚴(yán)防錯(cuò)配。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分2）、模板DNA：

基因組DNA、質(zhì)粒DNA、其它DNA片段；

質(zhì)量要求：不高3）、Taq酶(熱穩(wěn)定性)：常規(guī)酶高保真酶：ExTaqLaTaq酶4）、反應(yīng)緩沖液成分：

BSA、Tween20、DTT、明膠保護(hù)酶作用

Tris.cl提供緩沖作用本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分

4、影響PCR產(chǎn)量、質(zhì)量的因素：(1)

Taq酶：常用1-2.5U/反應(yīng)（25uL）

濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物不夠；

濃度高，非特異性擴(kuò)增增加；酶的活性；(2)

dNTP的濃度：常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特異性、保真性；本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分(3)模板：主要考慮純度及使用量對(duì)純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。使用量從幾個(gè)ng到100ng；(4)引物濃度：

μmol/L之間，過多則非特異擴(kuò)增增加，形成引物二聚體；(5)

Mg2+濃度：常用mol/L；影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分(6)

PCR反應(yīng)程序設(shè)定1）變性溫度和時(shí)間：要求變性徹底，但要考慮酶的半衰期：92.5℃（2小時(shí)）95℃（40min）97℃（5min）94℃變性比較徹底，酶的半衰期也不短。2）引物退火溫度Tm與時(shí)間；

Tm值由引物ATGC數(shù)決定每A、T計(jì)為2℃，G、C計(jì)為4℃，時(shí)間一般為40秒到60秒3）引物延伸溫度與時(shí)間：

72℃最佳，30-100nt/s，也有用68℃如LaTaq4）循環(huán)數(shù)：25-35cycles之間，過多則非特異擴(kuò)增增加；平臺(tái)效應(yīng)。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分以普通PCR50lreactionsolution為例)10PCRbuffer25mMMgCl2dNTPMixture(10mMeach)primer1（10M)primer2(10M)Taqpolymerase(5U/l)DNAtemplate(0.1g/l)ddH2Ototal5l(1)4l(2mM)1l(0.1mM)1l(0.2M)1l(0.2M)0.6l(2U/50l)1l36.5l50l5、PCR例子（Exampleofreactionsolution）反應(yīng)體系配置：本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分

PCRthermalprogram94C94CTm72C72C4C1min30sec30sec1min5Cendless30cycles循環(huán)數(shù)HeatdenaturationHeatdenaturePrimersannealingExtensionLastextensionEndingreactionTa:annealingtemperature設(shè)計(jì)的反應(yīng)程序相應(yīng)作用本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分6、PCR的種類RT-PCR特異PCR錨定PCR反向PCR套式PCR不對(duì)稱PCR長(zhǎng)程PCR鍋柄PCR免疫PCRRAPD定量PCR原位PCR本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分

F

R（1）特異PCR

擴(kuò)增所用的引物是特異的，擴(kuò)出的產(chǎn)物也是特定的。

（2）RT-PCR：是一類以mRNA為最初模板的基因的擴(kuò)增。AAAAAAAAAA5`CAPTTTTTTTTTTT本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分（3）反向PCR：根據(jù)已知序列擴(kuò)增兩側(cè)序列的方法。已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引物1此PCR操作過程：酶切基因組DNA連接環(huán)化目的DNA用引物1和引物2組合擴(kuò)增出側(cè)翼序列本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分（4）定量PCR廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測(cè)，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。狹義的定量PCR技術(shù)是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測(cè)PCR過程（監(jiān)測(cè)擴(kuò)增效率）達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時(shí)以內(nèi)對(duì)照有效排除假陰性結(jié)果（擴(kuò)增效率為零）。用途：分析基因組中某個(gè)基因的拷貝數(shù)或分析基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分

原理：通過實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)行定量及定性的分析。初始模板量X0的對(duì)數(shù)值與C(T)值之間呈線性關(guān)系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN

本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04閾值線Ct值Ct值Ct值的定義

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表thresholdCt值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段時(shí)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示）本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15

熒光域值（threshold）的設(shè)定本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分

研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04閾值線Ct值Ct值本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分熒光信號(hào)如何產(chǎn)生？1、SYBRGreen12、Molecular

Beacons3、TaqMan相關(guān)內(nèi)容見《分子生物學(xué)》本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分原理：用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。錨定PCR主要用于分析具有可變末端的DNA序列本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分原理：用不等量的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA(SSDNA).這對(duì)引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應(yīng)的最初10～15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA.不對(duì)稱PCR不對(duì)稱PCR主要為測(cè)序制備ss-DNA，尤為用cDNA經(jīng)不對(duì)稱PCR進(jìn)行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分第四節(jié)核酸雜交（印跡）技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分本節(jié)內(nèi)容印跡基本原理與過程DNA印跡（Southernblotting）RNA印跡（Northernblotting）斑點(diǎn)雜交原位雜交蛋白質(zhì)/DNA、蛋白質(zhì)/RNA雜交技術(shù)westernblotting（Pr）本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分核酸分子雜交技術(shù)是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術(shù)

雜交分子：彼此退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，而形成的雙鏈分子；作用：DNA/DNA的雜交作用檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間的親源關(guān)系；DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分核酸雜交常用幾種膜的性能比較本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分

1.核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細(xì)管作用

2.印跡雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的DNA/RNA進(jìn)行雜交。尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。1、DNA印跡雜交本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)過程在進(jìn)行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時(shí)：要將以轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤1～2小時(shí)；紫外線交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團(tuán)之間進(jìn)行交聯(lián)。利用Southern印跡法可進(jìn)行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）等。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分1979年，等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，又稱為Northernblotting。2、RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）應(yīng)用：Northern雜交技術(shù)應(yīng)用于特定性狀基因在mRNA水平上的動(dòng)態(tài)表達(dá)研究。應(yīng)用于定位克隆中尋找新基因，尋找染色體特定區(qū)域的表達(dá)序列是大多數(shù)人類遺傳疾病連鎖分析和定位克隆的主要限速步驟，Northern雜交作為尋找這些序列的有效方法，有助于這些疾病候選基因的篩選；本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分斑點(diǎn)印跡雜交是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種的快速檢測(cè)特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。是指將待測(cè)的DNA變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜,NC膜）上，用已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，洗膜(除去未接合的探針)，放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測(cè)。3、斑點(diǎn)印跡雜交（dotblotting）本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。應(yīng)用：鑒定重組子。4、菌落雜交意義：用原位雜交技術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水平來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分5、蛋白質(zhì)/DNA、蛋白質(zhì)/RNA雜交技術(shù)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gelretardationassay）又叫DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。原理：DNA與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時(shí)遷移率的降低。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分應(yīng)用：不僅可以用來鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結(jié)合的蛋白質(zhì)分子而且可以研究發(fā)生此中結(jié)合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA）?？梢蚤g接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。

用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)DNA，可檢測(cè)蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子在競(jìng)爭(zhēng)DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，引入突變可評(píng)估突變對(duì)競(jìng)爭(zhēng)DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gelretardationassay）本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分在凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA之間的競(jìng)爭(zhēng)作用（a）沒有加入競(jìng)爭(zhēng)DNA的正常的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，探針DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；（c）競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gelretardationassay）

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂驹隗w內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的有關(guān)信息，但無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。而DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)可以解決這個(gè)問題本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)是一類用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)（footprintingassay）如果使用較大的DNA片段，通過足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)一樣，我們也可以加入非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測(cè)定其核苷酸序列的特異性。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分原理：DMS能使裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異的化學(xué)切割。而與蛋白結(jié)合的DNA片斷上的G殘基不會(huì)被DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在DNA片斷的序列中，不存在具這些G殘基末端的DNA片斷，出現(xiàn)了空白區(qū)。硫酸二甲酯（DMS）足跡與DNA酶足跡法類似的技術(shù)，但不用DNA酶來分解未被蛋白質(zhì)結(jié)合保護(hù)的DNA部分，而是用硫酸二甲酯(DMS)來使未受保護(hù)的DNA甲基化，DNA可以在甲基化位置被化學(xué)降解，DNA分子上與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合區(qū)內(nèi)的堿基不能被DMS甲基化。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（methyltioninterferenceassay）根據(jù)DMS能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計(jì)出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，即甲基化干擾實(shí)驗(yàn)。這種技術(shù)可以檢測(cè)靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。主要局限性：它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分應(yīng)用甲基化保護(hù)作用進(jìn)行的體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分6、Westernblotting原理:與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。過程：經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。應(yīng)用：該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分第五節(jié)DNA測(cè)序技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分本節(jié)內(nèi)容Maxam-Gilbert化學(xué)分析法Sanger雙脫氧鏈終止法新發(fā)展的DNA雜交測(cè)序法本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分published:ProcNatlAcadSciUSA,vol741980NobelPrizeChemicalFSangerWGilbert本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分Maxam-GilbertDNAsequencingbychemicaldegradation化學(xué)降解法本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分1.Basicprinciple特定化學(xué)試劑可對(duì)堿基進(jìn)行特異性修飾在修飾堿基處(5‘或3’)打斷磷酸二酯鍵直接或間接特異性識(shí)別4種堿基生成起始于固定起點(diǎn)和終止于特定堿基的一組核苷酸片段本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分G反應(yīng)：DMS使鳥嘌呤的7位氮原子甲基化，其后斷開第8位碳原子和第9位氮原子間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。G+A反應(yīng)：甲酸使嘌呤環(huán)上的氮原子質(zhì)子化，削弱了腺嘌呤脫氧核糖核苷酸和鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸中的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。T+C反應(yīng)：肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生的堿基片段能被哌啶所置換。C反應(yīng)：在NaCl存在時(shí)，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分2.Procedure

TemplatesChemicalreaction

adefinedDNArestrictionfragmentradioactivelylabeledatoneendwith32PRunningPAGE(7Murea)6%~20%CleavagesatspecificbasesAutoradiography本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

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32PG從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分dideoxy-mediatedchain-terminationmethodBiologicalmethod本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；該酶能夠用2‘，3’--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3‘-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。（常用Klenow大片段，無5‘→3’外切酶活性）DNAsynthesiswillbeterminated

whenaddNTPisintegratedSanger雙脫氧鏈終止法的基本原理本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,

ddCTP,

ddGTP,ddTTPCATCGTACATCGTACGTAGCATCGTACCATCGTACGCATCGTACGTCATCGTACGTATemplateCATCGTACGTAGCprimer本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第60頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分A:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddCTPT:dNTP+ddTTPGATC5AAATCGTCGTCATCTAAAATACGAATACGTTGAAAGTGGGTAAG3本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第61頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分測(cè)序步驟①用M13噬菌體做載體獲得單鏈DNA模板，克隆并擴(kuò)增待測(cè)DNA片段，使其變性。②選擇一條與DNA單鏈互補(bǔ)的短鏈引物，將引物用放射性同位素標(biāo)記。③引物先同單鏈模板復(fù)性。④在四個(gè)反應(yīng)管中分別加入待測(cè)DNA單鏈模板、互補(bǔ)引物分子、四種的dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不同的ddNTP。⑤進(jìn)行聚合反應(yīng)，DNA新生鏈延長(zhǎng)，當(dāng)摻入ddNTP時(shí)，聚合反應(yīng)終止。⑥在聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠中電泳。⑦根據(jù)X底片對(duì)凝膠曝光所顯的條帶位置，讀出DNA序列。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第62頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第63頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分5ˊ

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32PG從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第64頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分新發(fā)展的DNA測(cè)序技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第65頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分DNA自動(dòng)測(cè)序儀的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了凝膠電泳、初始數(shù)據(jù)獲取、堿基閱讀等步驟自動(dòng)化。自動(dòng)測(cè)序儀的設(shè)計(jì)原理是采用熒光標(biāo)記DNA片段，并用激光激活的熒光探測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)序列反應(yīng)的分離產(chǎn)物，讀出電泳條帶所示的堿基順序。分離產(chǎn)物有兩種基本方法：?jiǎn)螣晒鈽?biāo)記四泳道分離和四熒光標(biāo)記的單泳道分離。

特點(diǎn)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第66頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分測(cè)序原理ABI公司（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）發(fā)展的四標(biāo)記單泳道法是用4種不同的熒光標(biāo)記物標(biāo)記4個(gè)反應(yīng)的引物，4個(gè)反應(yīng)在一個(gè)泳道中電泳分離。每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物用不同顏色的熒光標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分，再用計(jì)算機(jī)將經(jīng)過熒光探頭的不同顏色順序轉(zhuǎn)變成測(cè)序信息。這種同一泳道的分離避免了泳道間差異對(duì)測(cè)序的影響。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第67頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分ddGTPddATPddTTPddCTPKeytechniqueLabelingddNTPwith4kindofdRhodamine

EachdRhodaminegivedifferentcolor本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第68頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分2.測(cè)序步驟本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第69頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分A:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddCTPT:dNTP+ddTTP本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第70頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第71頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分計(jì)算機(jī)排序5ˊ本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第72頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第73頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分Strategy

for

sequencingaDNAfragment1.Primerwalking2.Randomclones本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第74頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分1.PrimerwalkingSynthesizingoligo-nucleotides一次測(cè)序反應(yīng)一般可讀出600～800bp，若待測(cè)序的DNA片斷較大，則需從多處不同的位置引導(dǎo)測(cè)序反應(yīng)。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第75頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分2.Randomclones對(duì)于更大的目標(biāo)片段：一次測(cè)序反應(yīng)一般可讀出600～800bp，若待測(cè)序的DNA片斷非常大，則可以將目標(biāo)片段打斷，然后進(jìn)行隨機(jī)克隆，構(gòu)建能夠覆蓋其全長(zhǎng)的文庫(kù)，然后對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，獲得一系列打斷的片段序列，最后通過拼接獲得全長(zhǎng)序列。本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第76頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第77頁(yè)；編輯于星期六\12點(diǎn)4分SolexaSOLiD新一代高通量測(cè)序技術(shù)本文檔共88頁(yè)；當(dāng)前第78頁(yè)；編輯于星期