基因工程基本操作程序1

專(zhuān)題1基因工程1.2基因工程的基本操作程序

1⒈概念：基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。⒉特點(diǎn)：基因工程能夠打破種屬的界限，在基因水平上改變生物遺傳性，并通過(guò)工程化手段為人類(lèi)提供有用的產(chǎn)品及服務(wù)?；蚬こ?非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)下游編碼區(qū)上游

RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控遺傳信息的表達(dá)核糖體基因的結(jié)構(gòu)（原核細(xì)胞）

RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來(lái)，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái)。3

能夠轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的信使RNA，進(jìn)而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，也就是說(shuō)能夠編碼蛋白質(zhì)

不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)：編碼區(qū)4編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA

內(nèi)含子:外顯子:56基因工程的基本操作程序

目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定7基因的直接分離或人工合成。即獲取含有所需要的完整的遺傳信息的DNA片段。從基因文庫(kù)中獲得目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因目的基因獲取方法第一步：獲取目的基因8

用限制酶切斷成許多片段從基因文庫(kù)中獲得目的基因

將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體菌的不同細(xì)胞中去，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。種類(lèi)：基因組文庫(kù)：cDNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因9構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。從基因文庫(kù)中獲得目的基因10基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)如何從基因文庫(kù)中獲得目的基因11利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因條件：已知目的基因的核苷酸序列過(guò)程：變性、退火、延伸、多次重復(fù)12人工合成基因法DNA合成儀

②直接合成法：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。①逆轉(zhuǎn)錄法：以信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。131、能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定的保存2、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)3、具有某些標(biāo)記基因4、對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害運(yùn)載體的選擇第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建14目的基因與運(yùn)載體結(jié)合

用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)后，在DNA連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。15作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？

不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。

16基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子＋標(biāo)記基因基因表達(dá)載體的功能：使目的基因在受體細(xì)胞中存在，并且遺傳給下一代；使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用啟動(dòng)子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA終止子：位于基因的尾端。終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：檢測(cè)受體細(xì)胞是否含有目的基因17第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

通過(guò)運(yùn)載體把目的基因帶入某生物體內(nèi)，并使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。導(dǎo)入擴(kuò)增

為使重組的DNA分子更容易進(jìn)入受體細(xì)胞，通常要用CaCl2對(duì)受體細(xì)菌進(jìn)行處理，使受體細(xì)菌具有更大的通透性。18農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞19農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法20農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法21農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)單子葉植物沒(méi)有感染力；Ti質(zhì)粒的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體上。轉(zhuǎn)化:目的基因插入T－DNA→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→穩(wěn)定維持和表達(dá)22方法：顯微注射技術(shù)操作程序：目的基因表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→體內(nèi)發(fā)育→新性狀動(dòng)物將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞23原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞轉(zhuǎn)化：Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞24常用方法——分子雜交技術(shù)DNA和DNA分子之間的雜交DNA和RNA分子之間的雜交蛋白質(zhì)分子（抗原—抗體）之間的雜交

第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定25（1）DNA和DNA分子之間的雜交

第一步，將受體生物DNA提取出來(lái)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)拿盖泻?，走瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的片段分開(kāi)；第二步，將凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第三步，用標(biāo)記了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作為探針與硝酸纖維素膜上的DNA進(jìn)行雜交；第四步，將X光底片壓在硝酸纖維素膜上，在暗處使底片感光；第五步，將X光底片沖洗，如果在底片上出現(xiàn)黑色條帶，則表明受體植物染色體DNA上有目的基因。26（2）DNA和RNA分子之間的雜交

它是檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA的方法，具體做法與（1）相同，只是第一步從受體植物中提取的是mRNA而不是DNA，雜交帶的顯現(xiàn)也與（1）相同。27（3）蛋白質(zhì)分子（抗原—抗體）之間的雜交

第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達(dá)出蛋白質(zhì)；第二步，將表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體（一抗）；第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；第四步，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第五步，將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交，這時(shí)抗體（一抗）與目的基因表達(dá)的蛋白（抗原）會(huì)特異結(jié)合。由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，它可以與一抗結(jié)合，二抗抗體上帶有特殊的標(biāo)記。如果目的基因表達(dá)出了蛋白質(zhì)，則結(jié)果為陽(yáng)性。28第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定

將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物2930思考與探究

農(nóng)桿菌可分為根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。根瘤農(nóng)桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約有93屬643種雙子葉植物對(duì)根瘤農(nóng)桿菌敏感。裸子植物對(duì)該菌也敏感。當(dāng)這些植物被該菌侵染后會(huì)誘發(fā)腫瘤。近年來(lái)，也有報(bào)道該菌對(duì)單子葉植物也有侵染能力。根瘤農(nóng)桿菌侵染植物是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會(huì)產(chǎn)生一些糖類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導(dǎo)作用。酚類(lèi)物質(zhì)和糖類(lèi)物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。31需要注意的是農(nóng)桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，是需要加上述酚類(lèi)物質(zhì)的，同時(shí)單子葉植物種類(lèi)不同，農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的效果也有很大差異。如果想將一個(gè)抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點(diǎn)：①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。32有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。33基本操作如下：（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（