基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組（proteome）:PROTEins+genOME，意為proteinexpressedbygenome—基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）:Thestudyoftheproteome—研究全部蛋白質(zhì)的存在及存在形式的一門(mén)學(xué)科根據(jù)研究目的，蛋白質(zhì)組學(xué)可分為

表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(expressionproteomics）

結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(structureproteomics)

功能蛋白質(zhì)組學(xué)(functionalproteomics)本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分1.表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)和量的變化，以及不同時(shí)間基因表達(dá)譜的改變2.結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)以繪制出蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或存在于一個(gè)特殊細(xì)胞器中的蛋白為研究目的，用于建立細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)圖譜并解釋某些特定蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的作用3.功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究在不同生理和病理?xiàng)l件下，細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和修飾本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分蛋白質(zhì)組學(xué)研究路線本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分主要技術(shù)1.雙向凝膠電泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）

第一向：等電聚焦（IEF），根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離第二向：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異進(jìn)行分離本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分2.雙向熒光差異凝膠電泳（two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE）

采用專(zhuān)有的熒光染料與多重樣本和圖像分析的方法，在同一塊膠上可同時(shí)分離多個(gè)有不同熒光標(biāo)記的樣品，并以熒光標(biāo)記的樣品混合物為內(nèi)標(biāo)，對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)樣品和每個(gè)差異都可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度分析本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分生物質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)量的大小順序排列的圖像

質(zhì)譜儀是一類(lèi)能使物質(zhì)離子化并通過(guò)適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)、磁場(chǎng)將它們按空間位置、時(shí)間先后或軌道穩(wěn)定與否實(shí)現(xiàn)質(zhì)量比分離，并檢測(cè)強(qiáng)度后進(jìn)行物質(zhì)分析的儀器。質(zhì)譜儀主要由分析系統(tǒng)、電學(xué)系統(tǒng)和真空系統(tǒng)組成基本原理：通過(guò)對(duì)被測(cè)樣品離子的質(zhì)核比的測(cè)定來(lái)進(jìn)行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開(kāi)而得到質(zhì)量圖譜，通過(guò)樣品的質(zhì)量圖譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展1912英國(guó)物理學(xué)家Thomson研制成功第一臺(tái)質(zhì)譜儀20世紀(jì)20年代質(zhì)譜成為一種分析手段被化學(xué)家所采用40年代開(kāi)始質(zhì)譜廣泛用于有機(jī)物質(zhì)的分析1966Munson&Field報(bào)道了化學(xué)電離源，質(zhì)譜第一次可以檢測(cè)熱不穩(wěn)定的生物分子80年代隨著軟電離技術(shù)（快原子轟擊FAB、電噴霧ESI、基質(zhì)輔助激光解吸MALDI）的發(fā)展，生物質(zhì)譜得到了飛速發(fā)展本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分軟電離

在質(zhì)譜分析中，離子源是將分子離解成離子或解離成碎片，在這里分子失去電子，生成帶正電荷的分子離子。分子離子可進(jìn)一步裂解生成質(zhì)量更小的碎片離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對(duì)于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。通常稱(chēng)能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法，后一種方法適用于易破裂或易電離的樣品?！败洝笔窍鄬?duì)于最常用的電子電離EI而言。采用軟電離技術(shù)容易獲得能指明相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子（M+H）+、（M-H）+，但能提供結(jié)構(gòu)信息的碎片離子較少。本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分生物質(zhì)譜的一般結(jié)構(gòu)本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分質(zhì)譜儀組成

樣品離子源形成離子(帶電分子)檢測(cè)質(zhì)譜質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器電離質(zhì)量分選(過(guò)濾)根據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理檢測(cè)離子基本步驟:1.樣品離子化2.根據(jù)質(zhì)量(m/z)不同分離離子3.檢測(cè)每種質(zhì)量離子的數(shù)目4.收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分生物質(zhì)譜儀的離子源與質(zhì)量分析器離子源ElectroSprayIonization(ESI)Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization(MALDI)質(zhì)量分析器TimeofFlight(TOF)IonTrap(IT)Quadrapoles(Q)FourierTransformIonCyclotronResonance(FT-ICR)

本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分ESI借助強(qiáng)電場(chǎng)使電子分離，當(dāng)樣品溶液以低流速經(jīng)毛細(xì)管流出后，在霧化器的輔助下霧化成細(xì)小的帶點(diǎn)液滴。這些液滴在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中逐漸脫溶劑化導(dǎo)致體積變小，表面電荷密度增大，當(dāng)達(dá)到一定極限時(shí)，液滴發(fā)生爆裂產(chǎn)生更小的液滴。如此不斷重復(fù)，直至液滴很小時(shí)，由于液滴表面電荷密度極大，足以從液滴中解析出分子離子，而后者最終進(jìn)入質(zhì)譜分析器本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分電噴霧離子化僅能容忍較低容量的緩沖溶液、鹽和表面活性劑，這些物質(zhì)可以和分析物形成化合物從而干擾分子量的測(cè)定或抑制分析物離子的形成。HPLC是分離去除污染物的常用手段，而ESI的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以很容易的和HPLC等各種預(yù)分離技術(shù)相連接。隨著20世紀(jì)90年代，納噴霧的出現(xiàn)，ESI-MS靈敏度大大提高，已經(jīng)可以檢測(cè)Femtomole(毫微微克分子)和Attomole(10-18mole)級(jí)的生化樣品本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分DESI(desorptionelectrosprayionization)

該技術(shù)的突破在于可以直接在大氣壓環(huán)境下分析未經(jīng)任何處理的樣品，如皮膚、花朵、尿液、生理組織等

DESI直接將電噴霧的帶點(diǎn)液滴和溶劑離子射向被分析物表面，就可以使樣品表面的分子解吸附并帶上電荷被質(zhì)譜檢測(cè)。Cooks課題組曾使用DESI技術(shù)直接分析人肝腺癌組織樣品，成功找到一些特殊磷脂在癌變區(qū)域含量異常升高的現(xiàn)象，而這些磷脂的存在正是和人體器官內(nèi)機(jī)能紊亂神經(jīng)酰胺引導(dǎo)的細(xì)胞死亡通路相關(guān)聯(lián)本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分DART(directanalysisinrealtime)本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分MALDI使用基質(zhì)的目的是為了保護(hù)待分析物不會(huì)因過(guò)強(qiáng)的激光能量導(dǎo)致化合物被破壞使用特定波長(zhǎng)的激光（常用337nm和355nm紫外激光、1.06μm紅外激光等）照射到樣品靶上，樣品靶上的基質(zhì)將吸收到的能量傳遞給樣品，使樣品產(chǎn)生瞬間膨脹相變而發(fā)生本體解吸，使樣品離子化本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分常規(guī)的MALDI源處在真空系統(tǒng)內(nèi)，不允許MALDI-MS直接在線和其他樣品預(yù)分離系統(tǒng)聯(lián)用，也無(wú)法直接和其他自動(dòng)化、機(jī)器人處理系統(tǒng)聯(lián)用，不可避免影響整個(gè)MALDI-MS樣品檢測(cè)的高通量性APMALDI(AtmospherePressure)SELDI(SurfaceEnhanced本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分TOF離子在離子源里產(chǎn)生，在電壓為V的電場(chǎng)作用下加速，飛過(guò)漂移區(qū)后到達(dá)檢測(cè)器內(nèi)，這段飛行時(shí)間為其在加速區(qū)中飛行時(shí)間和漂移區(qū)的飛行時(shí)間之和，正比于其質(zhì)量的平方根IT離子阱的上下端罩與左右環(huán)電極構(gòu)成可變電場(chǎng)，帶電離子在一定軌道上旋轉(zhuǎn)，改變電壓可使相同m/z離子依次離開(kāi)進(jìn)入電子倍增器而分離Q樣品離子沿電極間軸向進(jìn)入電場(chǎng)后，在極性相反的電極間振蕩，只有質(zhì)荷比在某個(gè)范圍的離子才能通過(guò)四級(jí)桿到達(dá)檢測(cè)器，其余離子因振幅過(guò)大與電極碰撞，放點(diǎn)中和后被抽走FT-ICR離子在磁場(chǎng)作用下成為回旋離子，離子回旋時(shí)吸收與磁場(chǎng)垂直的電場(chǎng)能量，當(dāng)離子能量和吸收能量相等時(shí)產(chǎn)生共振，此時(shí)切斷交變電場(chǎng)，回旋離子在電極上產(chǎn)生感應(yīng)電流，感應(yīng)電流隨時(shí)間衰減，記錄該信號(hào)并通過(guò)傅里葉變換將時(shí)域圖轉(zhuǎn)換為頻域圖（質(zhì)譜圖）本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分01TOF離子在離子源里產(chǎn)生，在電壓為V的電場(chǎng)作用下加速，飛過(guò)漂移區(qū)后到達(dá)檢測(cè)器內(nèi)，這段飛行時(shí)間為其在加速區(qū)中飛行時(shí)間和漂移區(qū)的飛行時(shí)間之和，正比于其質(zhì)量的平方根離子阱的上下端罩與左右環(huán)電極構(gòu)成可變電場(chǎng)，帶電離子在一定軌道上旋轉(zhuǎn)，改變電壓可使相同m/z離子依次離開(kāi)進(jìn)入電子倍增器而分離03Q樣品離子沿電極間軸向進(jìn)入電場(chǎng)后，在極性相反的電極間振蕩，只有質(zhì)荷比在某個(gè)范圍的離子才能通過(guò)四級(jí)桿到達(dá)檢測(cè)器，其余離子因振幅過(guò)大與電極碰撞，放點(diǎn)中和后被抽走02IT04FT-ICR離子在磁場(chǎng)作用下成為回旋離子，離子回旋時(shí)吸收與磁場(chǎng)垂直的電場(chǎng)能量，當(dāng)離子能量和吸收能量相等時(shí)產(chǎn)生共振，此時(shí)切斷交變電場(chǎng)，回旋離子在電極上產(chǎn)生感應(yīng)電流，感應(yīng)電流隨時(shí)間衰減，記錄該信號(hào)并通過(guò)傅里葉變換將時(shí)域圖轉(zhuǎn)換為頻域圖（質(zhì)譜圖）本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分MALDI-TOF-MS質(zhì)譜的分析步驟2.樣本被激光電離形成多肽離子混合物

Pulsedlaser3.多肽離子在TOF管里飛行，飛行速度取決于多肽離子的M/Z的大小1.基質(zhì)與多肽樣本共同置于剛靶上5.檢測(cè)到每個(gè)離子的M/Z后，同一張圖譜上計(jì)算機(jī)輸出每個(gè)肽段M/Z，即蛋白質(zhì)的多肽圖譜，通過(guò)與理論數(shù)據(jù)庫(kù)中的肽圖片比對(duì)，從而鑒定蛋白4.到達(dá)檢測(cè)器的離子，通過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)出每個(gè)肽段離子的M/ZTimeFlighttubeHighvacuumHighvoltage20-25kV本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分現(xiàn)在生物質(zhì)譜主要在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中承擔(dān)以下任務(wù)：（1）通過(guò)精準(zhǔn)的質(zhì)量分析器來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確分子量或檢測(cè)肽指紋譜（2）通過(guò)CID、CAD、PSD等串級(jí)方式對(duì)肽段進(jìn)行序列測(cè)定（3）對(duì)蛋白質(zhì)巰基及二硫鍵進(jìn)行定位（4）對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾狀況進(jìn)行定位（5）檢測(cè)生物分子相互作用及非共價(jià)化合物本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的利用1.蛋白質(zhì)的定性分析依據(jù)分析對(duì)象是整體蛋白質(zhì)混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白質(zhì)組的定性分析方法分為自下向上法（bottom

up，針對(duì)多肽混合物）和自上向下法(top

down，針對(duì)整體蛋白質(zhì)混合物)。

依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中是否存在所鑒定的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組的定性分析方法進(jìn)一步分為：對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中含有待鑒定的蛋白質(zhì)，包括：肽質(zhì)量指紋譜法（PMF，適合于簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)混合物)；肽序列標(biāo)簽法（PST，適合于復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物）

。對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在待鑒定的蛋白質(zhì)，采用從頭測(cè)序法（de

novo）

本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分Schematicshowingthetop-downandbottom-upapproachestoproteinanalysisandidentification.Inthetop-downapproach,theintactproteinisfragmentedinthegas-phasetocreatesequence-specificfragmentionstoaidinsequenceanalysis.Thebottom-upapproachusesproteolyticenzymestocreatepeptidesforsequenceanalysisusuallybyusingmultidimensionalliquidchromagoraphyincombinationwithtandemmassspectrometry本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分

自頂向下策略是以蛋白質(zhì)分子整體作為分析對(duì)象，通過(guò)蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋（peptide

mass

fingerprinting,PMF）對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定的方法。為了有效地克服質(zhì)量簡(jiǎn)并的現(xiàn)象，減少搜索目標(biāo)的范圍，一般選擇高精度和高分辨率的質(zhì)譜，如傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（2ppm，50000）。該策略具有較高的序列覆蓋度和翻譯后修飾特征的保持，適合于翻譯后修飾及特殊的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的分析。不足的是，(1)實(shí)驗(yàn)樣品蛋白質(zhì)需要高度純化；(2)在目前的實(shí)驗(yàn)條件下，較難分析大分子量的蛋白質(zhì)。

自底向上策略,

稱(chēng)之為鳥(niǎo)槍法,

是利用串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，即肽碎片指紋（peptide

fragment

fingerprinting，PFF）來(lái)鑒定肽段序列，然后再推斷組裝樣品中包含的蛋白質(zhì),

是常用的高通量分析策略。由于肽碎片攜有呈幾何增長(zhǎng)的組合信息，可以消除質(zhì)量簡(jiǎn)并之憂，對(duì)質(zhì)譜的質(zhì)量分辨率要求不高，多用于對(duì)復(fù)雜樣品的混合物進(jìn)行高通量分析。本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分成功鑒定樣品酶解酶解片斷一級(jí)質(zhì)譜PMF肽指紋圖譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)庫(kù)檢索序列數(shù)據(jù)庫(kù)PSMs及后篩選De-novo序列分析未知蛋白蛋白質(zhì)鑒定流程本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分定性蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分2.蛋白質(zhì)的定量分析

定量蛋白質(zhì)組學(xué):把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確地定量和鑒定

原理：對(duì)于具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽可以通過(guò)比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)度或峰面積得到待比較蛋白質(zhì)的相對(duì)量

本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分方法

1.直接進(jìn)行比較，包括SDS、2DE、HPLC;2.標(biāo)記方法，包括同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽（ICAT、iTRAQ）、元素標(biāo)記親和標(biāo)簽（ECAT）、酶促18O標(biāo)記、DYGE技術(shù)和同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記（SILAC)本文檔共33頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)12分例：iTRQA試劑結(jié)合生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量方法(1)試劑的反應(yīng)基團(tuán)（PRG）特異地與肽段的N