Survivin基因靶向RNA干擾重組表達(dá)載體的構(gòu)建和測序

Survivin基因靶向RNA干擾重組表達(dá)載體的構(gòu)建和測序【摘要】目的：利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，以survivin為靶基因,設(shè)計構(gòu)建重組表達(dá)載體，并進(jìn)行測序鑒定.方法：設(shè)計具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條DNA序列，經(jīng)退火成互補雙鏈，再克隆至載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒行酶切鑒定后，并進(jìn)行序列測定.結(jié)果：將合成的DNA序列退火后克隆到載體上，經(jīng)酶切和測序鑒定確實為所需序列.結(jié)論：Survivin靶向RNA干擾重組表達(dá)載體的構(gòu)建成功，可利用所得的小RNA序列干擾survivin基因的mRNA轉(zhuǎn)錄，供抗腫瘤研究參考.

【關(guān)鍵詞】survivin基因；RNA干擾；重組表達(dá)載體

0引言

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù).用小片段RNA二聚體(smallinterferingRNA,siRNA)對高等哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，成功排除了長片段雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)引起非特異性干擾的現(xiàn)象，但其主要障礙是長于30nt的雙鏈RNA將激活抗病毒機(jī)制，導(dǎo)致非特異性的RNA轉(zhuǎn)錄降解.而體外合成21nt的siRNA能夠成功地特異性抑制哺乳動物的基因表達(dá)［1-3］.本實驗我們針對凋亡抑制蛋白(inhibitionapoptosisprotein,IAP)基因家族的survivin基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(smallhairpinRNA,shRNA)構(gòu)建重組表達(dá)載體，為體外和體內(nèi)抗腫瘤研究提供平臺.

1材料和方法

材料

含有人H1啟動子的pSilencer質(zhì)粒為美國Ambion公司產(chǎn)品，由西南醫(yī)院皮膚科王繼文博士贈送.克隆用大腸桿菌DH5α由本校燒傷科實驗室董征學(xué)碩士贈送.限制性內(nèi)切酶BamHⅠ,HindⅢ及T4DNA連接酶、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)λHindⅢdigest,DL2000均為TaKaRa公司產(chǎn)品.質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒均為美國Omega公司產(chǎn)品.

方法

基因干擾片段shRNA的設(shè)計與合成氯化鈣法制備DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞凍存于-70℃?zhèn)溆?；擴(kuò)增和純化質(zhì)粒根據(jù)Genbank中報道的survivin基因核苷酸序列(NoNM001168)，參考shRNA設(shè)計原則進(jìn)行設(shè)計［4］，最后選擇出三條片段作為survivin基因干擾片段.以間隔序列連接干擾片段正向和反向序列，兩端加酶切位點，最后得到具有回文結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpinsiRNA)的干擾片段序列，并將其送北京賽百盛生物試劑公司合成.

表達(dá)載體的構(gòu)建將每對要退火的兩條片段分別取2μL與46μL退火緩沖液混合，利用PCR儀加熱至95℃3min，然后70℃水浴,自然冷卻至室溫.用45μL的無酶去離子水稀釋5μL的退火雙鏈，使其終濃度為8mg/L.載體經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切.將退火片段與經(jīng)酶切后的載體按摩爾比3∶1的比例進(jìn)行連接反應(yīng)，同時設(shè)立陰性對照和質(zhì)粒的陽性對照反應(yīng)，置16℃過夜.將連接產(chǎn)物各取4μL分別接種于100μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化.挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，質(zhì)粒小量抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒試抽提.用限制性內(nèi)切酶BglⅡ分別對重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切(此位點為目的序列所特有的酶切位點)鑒定.得到的重組質(zhì)粒分別命名為,,

重組質(zhì)粒測序鑒定將鑒定證實后的三個重組質(zhì)粒各取1管菌液送大連寶生物工程有限公司測序.所用引物為M13+.

2結(jié)果

載體雙酶切鑒定回收酶切產(chǎn)物行12g/L瓊脂糖凝膠電泳后，可見環(huán)狀質(zhì)粒已被切開,大片段約為kb，小片段為61bp因太小而無法檢測.

篩選重組質(zhì)粒，pSilencer，pSilencer培養(yǎng)板上均有細(xì)菌克隆長出，形態(tài)和大小基本一致；質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化對照有大量細(xì)菌克隆長出；陰性對照培養(yǎng)板上無細(xì)菌克隆長出，連接轉(zhuǎn)化可能成功.

單酶切鑒定重組質(zhì)粒第2孔經(jīng)BglⅡ單酶切的，因該質(zhì)粒無此酶切位點故仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)；第4，6，8孔為經(jīng)BglⅡ單酶切的三個重組質(zhì)粒，因該重組質(zhì)粒含有此酶切位點故可被酶切成線狀結(jié)構(gòu).

重組質(zhì)粒測序鑒定測序結(jié)果均包含目的序列(圖3）.

3討論

腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常的疾病，同時也是凋亡異常的疾病.腫瘤中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象很可能是機(jī)體對抗腫瘤的主動措施，因此細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療中起著關(guān)鍵性的作用.細(xì)胞凋亡(apoptosis)受多個基因的凋控，抑制凋亡的基因主要包括bcl2基因家族和IAP家族.其中，survivin基因是IAP基因家族的新成員.1997年Ambrosini等［5］利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1cDNA在人類基因組文庫中篩選克隆得到的新基因.SurvivinN端含有一個桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列(BIR)分子，其中含有對抑制凋亡有重要作用的氨基酸殘基Trp67，Pro33和Cys84，survivin通過這些氨基酸殘基與Caspase3和Caspase7結(jié)合抑制Caspase的活性，在COOH端有一個由40個氨基酸組成的α螺旋結(jié)構(gòu)，通過α螺旋結(jié)構(gòu)與細(xì)胞分裂微管結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡.Survivin基因特異性表達(dá)于人和鼠的胚胎發(fā)育組織，在終末分化的成人組織中不表達(dá)，而在轉(zhuǎn)化細(xì)胞株和人體內(nèi)大多數(shù)惡性腫瘤組織中明顯表達(dá)［6］.它與細(xì)胞凋亡和增殖、腫瘤血管的生成密切相關(guān)，還參與細(xì)胞周期凋控，并影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展.因此，以survivin為靶點的腫瘤基因治療成為腫瘤治療研究的重要方面.

測序鑒定

抑制基因表達(dá)的方法很多，目前研究使用較多的主要有反義RNA技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、基因敲除等.反義RNA技術(shù)的使用量較大，抑癌效率低.而RNAi則具有選擇余地大和擴(kuò)增放大效應(yīng)［7］，只需微量特異的dsRNA即可產(chǎn)生明顯的抑癌效果，具有抑制作用強、穩(wěn)定性高、細(xì)胞攝取相對容易等優(yōu)點.除了技術(shù)方面的差別，兩者的作用機(jī)制也不同.RNAi技術(shù)中siRNA序列選擇余地大，21~23nts中如果改變一個核苷酸，就可以使該siRNA序列不對靶向mRNA起作用，因此RNAi可以應(yīng)用于單個核苷酸突變基因的抑制表達(dá).以質(zhì)粒為載體將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，所形成的siRNA專一作用于靶向基因的細(xì)胞系可用于較長時間的功能研究［8-9］.RNAi技術(shù)與基因敲除技術(shù)相比，后者往往需要較長時間才能了解所缺失功能基因后的生物學(xué)現(xiàn)象，而前者則在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后即可了解抑制靶向基因表達(dá)后的生物學(xué)現(xiàn)象.

質(zhì)粒包括一種人H1RNA聚合酶Ⅲ啟動子，利用相對單一的啟動子和終止序列產(chǎn)生大量的小RNA.同時，位于啟動子下游的shRNA是為了在RNAi質(zhì)粒進(jìn)入宿主表達(dá)后，單鏈的RNA配對形成短的dsRNA，引發(fā)RNA干擾.而且，該載體中含有可供篩選的潮霉素耐藥基因和氨卞青霉素耐藥基因，利于陽性重組子的克隆篩選.因此，我們根據(jù)Genbank中報道的survivin基因核苷酸序列，參考shRNA設(shè)計原則設(shè)計出了三條阻斷survivin基因表達(dá)的RNAi序列，并成功克隆至載體，為進(jìn)一步研究體內(nèi)外抗腫瘤治療提供新方法.

【參考文獻(xiàn)】

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［3］ElbashirSM,MartinezJ,PatkaniowskaA,etal.FunctionalanatomyofsiRNAsformediatingefficientRNAiinDrosophilamelanogasterembryolysate［J］.EMBOJ,2001,20(23):6877-6888.

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［6］AdidaC,CrottyPL,McGrathJ,etal.Developmentallyregulatedexpressionofthenovelcancerantiapoptosisgenesurvivinginhumanandmousedifferentiation［J］.AmJPathol,1998,152(1):43.

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