Velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡研究

Velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡研究【摘要】為了研究velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡效應(yīng)及機(jī)制，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)2、10、50和100nmol/Lvelcade處理U266細(xì)胞活率，用流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基，用半定量RT-PCR法檢測(cè)bcl-2mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明：velcade抑制U266細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，24小時(shí)Annexin-V陽性細(xì)胞比例增高，△ψM降低；12小時(shí)時(shí)活性氧明顯增高，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；抗凋亡基因bcl-2表達(dá)降低。結(jié)論：velcade對(duì)U266細(xì)胞具有增殖抑制和殺傷作用，其可通過內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】velcade;多發(fā)性骨髓瘤;細(xì)胞凋亡

MultipleMyelomaCellLineU266ApoptosisInducedbyVelcade

AbstractToinvestigatetheeffectofvelcadeonmultiplemyelomacelllineU266apoptosisanditsmechanism，cellviabilitywasestimatedbytrypanbluedyeexclusion.Annexin-V，mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAwereexaminedbyflowcytometry，theexpressionofbcl-2mRNAwasdetectedbysemi-quatitativeRT-PCR.TheresultsshowedthatthevelcadeinhibitedthegrowthofU266cellsandreducedcellviabilityaccompaniedbyappearanceofmorphologiccharacteristicsofapoptosis.Velcadeat50nmol/LincreasedAnnexinVpositivityandfluorescenceintensityofDCFbecauseofROSgenerationwhileitdecreasedtheΔψmofU266cells.Expressionofanti-apoptoticgenebcl-2mRNAalsodecreased.ItisconcludedthatvelcadeinhibitethegrowthandreducecellviabilityofU266cells.VelcadecaninduceU266cellsapoptosisbyintrinsiccellapoptoticpathway.

Keywordsvelcade;multiplemyeloma;apoptosis

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細(xì)胞克隆性增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，多發(fā)生于老年人。隨著社會(huì)人口的老齡化，其發(fā)病率呈逐漸增高的趨勢(shì)。幾十年來對(duì)MM一直采用激素和細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合治療，盡管近年來加用反應(yīng)停抑制血管新生治療或采用自體骨髓移植治療，但其仍是一種不可治愈的血液系統(tǒng)腫瘤。由此可見，開發(fā)新的治療方法有重要的臨床價(jià)值。蛋白酶體抑制劑近年來作為MM新的治療制劑用于臨床試驗(yàn)，本研究就臨床新藥蛋白酶體抑制劑velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞的凋亡作用進(jìn)行探討。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)

U266細(xì)胞置于含10%的熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2和95%空氣濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞以×105細(xì)胞/毫升的密度接種培養(yǎng)，并與不同濃度velcade一起進(jìn)行孵育，對(duì)照加DMSO。細(xì)胞活率由臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)，根據(jù)處理組存活細(xì)胞數(shù)與死細(xì)胞數(shù)的比例來計(jì)算。形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞用cytospin(Shandon，Runcorn，UK)收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。生長抑制率及細(xì)胞活率按如下公式計(jì)算

生長抑制率＝［(對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-處理組細(xì)胞數(shù))／對(duì)照組細(xì)胞數(shù)］×100%存活率＝［活細(xì)胞數(shù)／(活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù))］×100%

Annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基的流式細(xì)胞儀分析

Annexin-V分析

使用FITC標(biāo)記的AnnexinV和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，根據(jù)BectonDickinsonBiosciences公司提供的說明書進(jìn)行操作。簡單地說，取×105細(xì)胞，經(jīng)PBS漂洗后加100μl結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，加5μlAnnexinV-FITC，10μlPI避光孵育15分鐘后加400μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

線粒體跨膜電位(Δψm)檢測(cè)

取5×105細(xì)胞，用PBS清洗1次，加入10μg/mlRh12337℃孵育30分鐘，用PBS漂洗1次，加入終濃度10μg/mlPI4℃暗處放置30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

活性氧測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［1］方法進(jìn)行，DCFHDA(Sigma公司產(chǎn)品)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。DCF的激發(fā)波長為485nm，吸收波長為530nm。將藥物處理的細(xì)胞經(jīng)過PBS洗滌，重懸于1ml含有10μmol/LDCFHDA的PBS中，以未加染料的樣品作為對(duì)照，37℃孵育20分鐘，以PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)5000個(gè)活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266bcl-2mRNA表達(dá)的半定量RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞總RNA抽提收集3×106細(xì)胞，用TRIzoL試劑按說明書抽提細(xì)胞總RNA。

cDNA合成及PCR擴(kuò)增方法參見文獻(xiàn)［2］，PCR引物：GAPDH：有義鏈5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′；反義鏈5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。bcl-2:有義鏈5′-ACTTGTGGCCCAGATAGG-3′，反義鏈為5′-CGACTTCGCCGAGATGTC-3′。PCR產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析照相，在雙波長色譜掃描儀上掃描電泳帶。GAPDH片段長度216bp，bcl-2片段389bp。

結(jié)果

velcade對(duì)U266細(xì)胞增殖抑制和殺傷作用

研究結(jié)果表明，velcade可以抑制U266細(xì)胞的生長，同時(shí)伴有細(xì)胞活率的降低。U266細(xì)胞經(jīng)2、10、50和100nmol/L濃度velcade24小時(shí)處理后生長抑制率的3次均值分別為％、％、％和％，48小時(shí)時(shí)分別為％、%、％和％；在0、2、10、50和100nmol/L濃度時(shí)24小時(shí)活率分別為％、％、％、％和％，48小時(shí)時(shí)分別為％、％、％、％和%。根據(jù)活率48小時(shí)時(shí)下降70％-80％選擇藥物濃度，因此選擇velcade50nmol/L作為藥物處理濃度。

velcade對(duì)U266細(xì)胞凋亡作用

50nmol/Lvelcade處理的U266細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為染色體凝聚、細(xì)胞核破裂而細(xì)胞膜保持完整及出現(xiàn)多個(gè)凋亡小體等。24小時(shí)AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞比例重復(fù)3次的均值為％，明顯高于未用velcade處理對(duì)照組的%。線粒體跨膜電位檢測(cè)顯示△ψM降低，Rh123陽性細(xì)胞比率重復(fù)3次的均值為%，對(duì)照為%。

活性氧檢測(cè)

我們采用DCFHDA檢測(cè)velcade處理的U266細(xì)胞活性氧及平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12小時(shí)時(shí)活性氧明顯增高，平均熒光強(qiáng)度顯著增高，由對(duì)照的增強(qiáng)到，流式細(xì)胞儀直方圖右移。

bcl-2檢測(cè)

采用RT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路最主要的基因bcl-2。結(jié)果顯示，U266細(xì)胞經(jīng)50nmol/Lvelcade處理后，隨著作用時(shí)間的延長，其表達(dá)逐漸降低。

討論

泛素-蛋白酶體通路是由泛素化系統(tǒng)和蛋白酶體組成，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和腫瘤生長中有著重要的作用，該通路參與細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)的蛋白降解，如許多重要的涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)蛋白。蛋白酶體存在于所有的真核細(xì)胞中，蛋白酶體抑制劑可以通過干涉這些重要蛋白的降解，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而使腫瘤進(jìn)展延緩或靜止［3-7］。

Velcade是一種硼酸二肽化合物，是高選擇性、可逆性的26S蛋白酶體抑制劑，首先在美國國家腫瘤協(xié)會(huì)的一組60種腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出抗腫瘤作用。velcade對(duì)MM細(xì)胞的作用表現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制生長、抑制細(xì)胞黏附和骨髓血管生成等多個(gè)方面。本研究顯示，其對(duì)U266細(xì)胞具有增殖抑制作用，并隨著時(shí)間的延長和劑量的增加呈現(xiàn)增殖抑制加強(qiáng)，活率降低趨勢(shì)。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有3種信號(hào)通路：FAS信號(hào)通路、線粒體信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路，目前認(rèn)為線粒體途徑在凋亡過程發(fā)揮樞紐作用。細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會(huì)被破壞，發(fā)生磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由內(nèi)層向外層的翻轉(zhuǎn)，暴露在外面的磷脂酰絲氨酸可被周圍的吞噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬，從而使凋亡細(xì)胞得以被清除。

AnnexinV為一種磷脂結(jié)合蛋白，可特異性地識(shí)別細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，所以經(jīng)常被用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡［8］。Rh123是一種親脂性陽離子，可發(fā)射綠色熒光，它可被線粒體吸收，并且其吸收量與線粒體△ψm成正比［9］。正常的活細(xì)胞因?yàn)榫€粒體△ψm高，所以其攝入的Rh123也高，因此細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光。而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)線粒體△ψm會(huì)降低，細(xì)胞表現(xiàn)為Rh123低染。本研究結(jié)果顯示，Velcade處理U266細(xì)胞24小時(shí)時(shí)凋亡細(xì)胞明顯增高，△ψm明顯降低，這說明細(xì)胞大部分是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而死亡的，Velcade還可通過線粒體信號(hào)通路，即內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。

ROS是細(xì)胞有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一些小分子物質(zhì)，主要包括O-2、OH-及其活性衍生物如H2O2、HOCl、O2等。這些物質(zhì)具有較高的反應(yīng)活性，易與細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的廣泛損傷，如膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)及核酸等的氧化損傷等。近年的研究認(rèn)為，活性氧是細(xì)胞凋亡的信號(hào)之一，ROS的產(chǎn)生可直接或間接改變線粒體膜電位，促進(jìn)CytC從線粒體內(nèi)釋放，啟動(dòng)線粒體信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中同樣會(huì)有ROS的生成。Fribley等報(bào)道［11］蛋白酶體抑制劑velcade通過同時(shí)誘導(dǎo)ER應(yīng)激和ROS生成引起人頭頸癌細(xì)胞凋亡，ROS的抑制劑Tiron能夠顯著抑制凋亡，caspase-9和caspase-3的活化，并且能夠阻礙ER應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表達(dá)。這些結(jié)果提示，ROS在ER應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。用DCFHDA作為熒光探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)velcade在24小時(shí)時(shí)能明顯增高U266細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，這說明velcade可改變多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，導(dǎo)致線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生ROS增多，從而誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。由此我們推測(cè)，不僅線粒體途徑參與了velcade誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡，而且ER應(yīng)激途徑也可能通過ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。

bcl-2基因是抗細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，其表達(dá)的增高與多種腫瘤有著密切關(guān)系，并且可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗糖皮質(zhì)激素、柔紅霉素、阿糖胞苷及VP16等化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，使腫瘤細(xì)胞對(duì)各種化療藥物耐受，導(dǎo)致緩解率低［12］。bcl-2表達(dá)降低在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡即線粒體信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，很多化療藥物可通過抑制bcl-2基因表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究通過半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了bcl-2mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)水平降低，并隨著velcade藥物作用時(shí)間的延長而表達(dá)量逐漸減少，這一結(jié)果從分子水平進(jìn)一步證實(shí)了velcade的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及其作用機(jī)制主要是通過線粒體信號(hào)通路。

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