基因工程第三章

基因工程第三章第一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.1.1分子雜交與印漬技術(shù)的原理

分子雜交：不同來源的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們具有大致相同的堿基序列，經(jīng)過退火處理，就能重新形成雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為分子雜交（molecularhybridization）。3.1分子雜交與印漬技術(shù)第二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日0復(fù)性RNADNA第三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。第四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日印漬技術(shù)：

Blotting印漬技術(shù)的原理首先由EdwenSouthern在1975年提出。第五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日其基本操作過程是：將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，置NaOH液中浸泡，從而將凝膠中的DNA變性為單鏈；然后將一張硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，上面放上大量吸水紙巾，利用吸水紙巾的毛細(xì)作用，將單鏈DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再將膜置80℃烘干并使單鏈DNA分子固定在膜上，再用于分子雜交分析。第六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③第七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日SouthernBlotting第八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用1、DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。2、RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。3、蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

第九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日三種印跡技術(shù)的比較第十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日探針技術(shù)：將已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。第十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.2PCR技術(shù)

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction），是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。第十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR基本原理：變性-復(fù)性-延伸1．變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到940C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。2．復(fù)性：通過降低反應(yīng)溫度至500C-650C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補(bǔ)鏈的3`端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。3．延伸：將反應(yīng)溫度提高到約720C，在耐熱DNA聚合酶的催化下，根據(jù)模板DNA提供的堿基順序，合成兩條互補(bǔ)鏈，從而使模板DNA擴(kuò)增一倍。第十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR技術(shù)特點(diǎn)1、高度的敏感性。2、高度的特異性。3、操作簡便快速。4、樣品適用廣泛。5、有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入。第十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日引物要擴(kuò)增模板DNA，首先要設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長度；兩引物的5’端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴(kuò)增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)也就更為重要。第十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日引物的設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)的必要條件是與引物互補(bǔ)的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為18～21個(gè)堿基，可以用DNA合成儀合成與其對(duì)應(yīng)互補(bǔ)的二條引物。

第十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日（1）引物長度：18-21bp（2）（G+C）%含量：引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中（G+C）%含量一般以40%～60%為佳。（3）引物的結(jié)構(gòu)：無明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)（4）引物之間：不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)(5）引物3’端配對(duì)精確和嚴(yán)格第十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日引物引物3’5’5’5’基因組引物第十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR的反應(yīng)原理第十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR技術(shù)的基本過程TaqDNA聚合酶模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃第二十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日1、dNTP:PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應(yīng)相同。2、緩沖液：10mMTris.HClpH8.3,50mMKCl,1.5mMMgCl2。3、模板DNA：純度與含量。4、反應(yīng)參數(shù)。PCR的影響因素第二十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日（1）變性--考慮酶的失活問題。一般為反應(yīng)開始時(shí)用95oC×2-5min，在后續(xù)循環(huán)中設(shè)為94oC×30s-1min;（2）退火--退火溫度取決于引物的堿基組成、長度及引物與模板的匹配程度，一般在Tm–20-25oC左右；時(shí)間一般為30s-2min；（3）延伸—溫度一般為72oC；時(shí)間取決于待擴(kuò)增片段的長度。在通常情況下，Taq酶的延伸速率約為2kb/min，而pfu為1kb/min。（4）在最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，需再在72oC下延伸10min，以產(chǎn)物完整。第二十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。為了保證反應(yīng)的特異性，還應(yīng)用ng級(jí)的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或102-105拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑以及結(jié)合在DNA上的蛋白。第二十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

模板的純度、含量測(cè)定

260nm1OD

雙鏈DNA50μg/ml

單鏈DNA40μg/ml

OD

260nm/

OD280nm≈1.8第二十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日ddH2O37.60μL10×Buffer5μLdNTPmixture(2.5mM)4μL引物上(20pmol/μL)1μL引物下(20pmol/μL)1μL

MgCl2(25mM)4μL模板(102-105

拷貝)0.5μLDNAPolymerase0.4μL總體積

50μL第二十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

95℃變性處理3min94℃30S56℃30S72℃1min30個(gè)循環(huán)

72℃延伸7min第二十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第二十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR產(chǎn)物純化

從凝膠上盡量小的切下目的片段,放在一個(gè)干凈的EP管中，稱取凝膠的重量，并加入3倍體積的BufferS1(即100mg膠加300μLBufferS1)；盛膠EP管于50℃水浴10min，每2-3min搖動(dòng)一次，至膠徹底融化；溶液加入到吸附柱內(nèi)，13000rpm離心1min，棄去收集管中的液體；第二十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

加入0.5mL的BufferW1洗滌DNA，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體，再加入0.5mL的W1Buffer，靜置1min，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體，13000rpm離心1min；把吸附柱放在一個(gè)干凈的EP管內(nèi)，在柱子膜中央加入30μLBufferT1,室溫放置1min,13000rpm離心1min。凝膠回收后的目的基因，各取5μL電泳檢測(cè)，并測(cè)定濃度以確定連接體系（此步必做）。第二十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第三十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第三十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第三十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR的主要用途

（一）目的基因的克?。篜CR技術(shù)是迅速獲得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：①利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因；第三十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日②利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的DNA片段；③利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機(jī)獲得目的基因。第三十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日（二）基因的體外突變：采用隨意設(shè)計(jì)的引物，在體外對(duì)基因進(jìn)行嵌合、缺失、點(diǎn)突變等改造。（三）DNA的微量分析：由于PCR技術(shù)具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析檢測(cè)。第三十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.3生物芯片生物芯片（biochip）的概念指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。第三十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日根據(jù)生物分子之間特異性相互作用的原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗體、受體-配體之間可發(fā)生的復(fù)性與特異性結(jié)合，設(shè)計(jì)一方為探針，并固定在微小的載體表面，通過分子之間的特性性反應(yīng)，檢測(cè)另外一方有無、多少或者結(jié)構(gòu)改變等第三十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細(xì)胞或組織的微點(diǎn)陣(microarray）。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。第三十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日生物芯片的主要特點(diǎn)：高通量、微型化和自動(dòng)化常用的生物芯片的分類：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片及芯片實(shí)驗(yàn)室第三十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因芯片（Genechip）又稱DNA芯片,是根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行分析。第四十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日2.蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)利用抗體與抗原特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)的原理，將蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）結(jié)合到固相支持物上，形成蛋白質(zhì)微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。第四十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日芯片實(shí)驗(yàn)室(labs-on-chip)高度集成化的集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)。實(shí)現(xiàn)生化分析全過程集成在一片芯片上完成，從而使生物分析過程自動(dòng)化、連續(xù)化和微縮化。芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。第四十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.4基因文庫的構(gòu)建第四十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因文庫基因組文庫第四十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第四十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日為什么要建立基因文庫？直接從含目的基因的生物中提取不行嗎？第四十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因文庫限制性內(nèi)切酶……克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫第四十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因組DNA文庫基因組DNA限制性內(nèi)切酶基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝第四十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日cDNA文庫的組建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA第四十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日如何從基因文庫中找到所需要的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)第五十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.6酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交技術(shù)是1989年由Fields等最先應(yīng)的。與其他技術(shù)相比，它省去了耗時(shí)耗力的蛋白表達(dá)純化以及抗體制備步驟，并且可以用于高通量的篩選，因此以其簡便、快捷與廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)迅速發(fā)展成為一種常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。根據(jù)對(duì)文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)，目前已知的蛋白質(zhì)相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的。第五十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日原理轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,簡稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,簡稱為AD),它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。第五十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白———蛋白的相互作用。主要結(jié)構(gòu)由含有DNA結(jié)合域和DNA轉(zhuǎn)錄激活域二類載體以及酵母報(bào)告株構(gòu)成。將DNA—BD與已知的誘餌蛋白質(zhì)X融合,構(gòu)建出BD-X質(zhì)粒載體;將AD基因與cDNA文庫,基因片段或基因突變體(以Y表示)融合,構(gòu)建出AD-Y質(zhì)粒載體。第五十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第五十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日酵母雙雜交系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)基本過程第五十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

3.7DNA堿基序列測(cè)定DNA堿基序列測(cè)定即DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學(xué)裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。第五十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：1．獲得待測(cè)DNA片段的單鏈模板：一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)量的單鏈待測(cè)DNA模板?？蓪⒋郎y(cè)DNA片段與噬菌體M13DNA進(jìn)行重組，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行增殖，M13噬菌體一般以單鏈DNA形式透出細(xì)胞再感染新的細(xì)菌，故此可獲得單鏈DNA模板。

第五十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日2．合成寡核苷酸引物：在待測(cè)DNA片段的3'-端合成一段互補(bǔ)的寡核苷酸引物，其順序可為待測(cè)DNA片段3'-端的一段已知順序，也可為一段M13噬菌體的順序?？衫肈NA合成儀自動(dòng)合成。3．模板-引物雜交：將待測(cè)單鏈DNA模板與寡核苷酸引物混合，并在適當(dāng)溫度條件下進(jìn)行保溫處理，使引物與DNA單鏈模板的3'-端進(jìn)行雜交。第五十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日4．互補(bǔ)鏈的延長和終止：將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四種dNTPS，一種帶放射性同位素標(biāo)記的脫氧核糖核酸（如α-32P-dATP）。此外，還需分別加入一種雙脫氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。然后在適當(dāng)溫度條件下延伸互補(bǔ)鏈，就可得到四組分別以A、G、C、T，終止的長短不一的互補(bǔ)鏈的混合物。因在互補(bǔ)鏈合成時(shí)，如摻入的是雙脫氧核糖核酸，由于缺乏3`-和2`-OH，故可導(dǎo)致互補(bǔ)鏈合成終止。第五十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星