植物組織培養(yǎng)省培

植物組織培養(yǎng)徐程浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院省培項目Objectives課程目標(biāo)了解植物組織培養(yǎng)的基本原理及概念了解植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用掌握培養(yǎng)基配置方法掌握無菌操作技術(shù)（進(jìn)行花菜花柄的試管苗誘導(dǎo)）測試不同植物激素對黃瓜子葉與下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織及分化的影響了解組培苗馴化移栽方法掌握鐵皮石斛人工種子制作問題植物自然條件下的繁殖方法有哪些？種子繁殖無性繁殖各種形態(tài)的種子種子和果實的產(chǎn)生無性繁殖植物組織培養(yǎng)的基本原理1902年，德國植物學(xué)家哈伯蘭特細(xì)胞全能性的理論是植物組培的理論基礎(chǔ)。1958年，美國植物學(xué)家斯蒂瓦特等人，用胡蘿卜韌皮部的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，終于得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)果，證實了哈伯蘭特在五十多年前關(guān)于細(xì)胞全能的預(yù)言。細(xì)胞的全能性1什么是細(xì)胞的全能性？2為什么細(xì)胞具有全能性？3各細(xì)胞的全能性一樣嗎？定義：1902年由Haberlandt提出，即：植物體的每一個具有完整細(xì)胞核的活細(xì)胞，都具有該植物所特有的全部遺傳信息，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。

20世紀(jì)80年代，每一個植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。植物細(xì)胞的全能性（Totipotency）細(xì)胞全能性的相對性:

細(xì)胞全能性并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物；動植細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。細(xì)胞按照分裂能力分為三類:第一類：始終保持分裂能力。如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞；第二類：永久失去分裂能力的終端分化細(xì)胞。如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞；第三類：在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的細(xì)胞。如表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細(xì)胞>厚壁細(xì)胞（木質(zhì)化細(xì)胞）>特化細(xì)胞（篩管、導(dǎo)管細(xì)胞）根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織（基本組織）>厚角組織>輔導(dǎo)組織>厚壁組織細(xì)胞全能性脫分化個體再生再分化細(xì)胞分裂

細(xì)胞全能性的實現(xiàn)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實現(xiàn)的。在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。二、植物組織培養(yǎng)技術(shù)1培養(yǎng)條件KNO31900MnSO4.4H2O22.3

NH4NO31650H3BO36.2

KH2PO4170KI0.83

MgSO4.7H2O370ZnSO4.7H2O8.6

CaCl2.2H2O440Na2MoO4.2H2O0.25

Na2.EDTA37.3CuSO4.5H2O0.025

FeSO4.7H2O27.8CoCl2.6H2O0.025

鹽酸硫胺素（VB1）0.1煙酸（VB5或VPP）0.5鹽酸吡哆醇（VB6）0.5肌醇100

甘氨酸2蔗糖30000

瓊脂10000

2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0.05~5萘乙酸（NAA）0.05~56-芐基腺嘌呤（6-BA）0.05~10MS培養(yǎng)基配方單位（mg/L）二、植物組織培養(yǎng)技術(shù)1培養(yǎng)條件營養(yǎng)物質(zhì)蔗糖無機(jī)鹽維生素水有機(jī)物氨基酸細(xì)胞分裂素類植物生長調(diào)節(jié)劑生長素類赤霉素類無機(jī)物有機(jī)營養(yǎng)凝固劑——瓊脂環(huán)境條件溫度濕度pH無菌光照——一般控制在23～28℃——操作臺、培養(yǎng)基、實驗儀器等——一般控制在70～80%——一般控制5.82植物組織培養(yǎng)過程脫分化愈傷組織再分化根芽植物體離體的植物器官、組織或細(xì)胞

（外植體）胚狀體①葉片接種到培養(yǎng)基上②產(chǎn)生愈傷組織③愈傷組織增殖④愈傷組織開始分化⑤愈傷組織分化出芽⑥培養(yǎng)基中的試管苗植物組織培養(yǎng)過程示意圖3植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)是利用植物體的離體器官、組織或細(xì)胞，無菌條件下在含有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上，給予適宜的光照、溫度、濕度等環(huán)境條件下進(jìn)行人工培養(yǎng)，使其增殖、生長、發(fā)育而形成完整的植株。植物組織培養(yǎng)的幾個概念愈傷組織原指植物體受傷時產(chǎn)生于傷口周圍的組織?，F(xiàn)多指切取植物體的一部分，置于含有生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的無定形的組織團(tuán)塊。主要由薄壁細(xì)胞構(gòu)成。胚狀體指離體培養(yǎng)條件下，沒有經(jīng)過受精過程，但是經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚狀類似物。培養(yǎng)基供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。無菌操作用于防止微生物進(jìn)入培養(yǎng)基和植物體的操作技術(shù)稱為無菌操作。植物激素是由植物自身代謝產(chǎn)生的一類有機(jī)物質(zhì)，并自產(chǎn)生部位移動到作用部位，在極低濃度下就有明顯的生理效應(yīng)的微量物質(zhì)，也被稱為植物天然激素或植物內(nèi)源激素。組培中常加入植物激素或人工合成激素類化合物調(diào)節(jié)器官分化。植物組織培養(yǎng)過程脫分化愈傷組織再分化根芽植物體離體的植物器官、組織或細(xì)胞

（外植體）胚狀體探究活動：探討影響植物細(xì)胞脫分化和再分化的因素[資料1]在快速繁殖顫楊時，如果我們將一個枝條平均分成三段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靠近頂端的那一段枝條的側(cè)芽離體培養(yǎng)時繁殖系數(shù)最高，中間的次之，基部的最低。結(jié)論：外植體在植株上的著生位置對其脫分化及再分化有一定的影響。探究活動：探討影響植物細(xì)胞脫分化和再分化的因素[資料2]在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的6-BA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的NAA，可誘導(dǎo)胡蘿卜形成愈傷組織；

在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mg/L的KT（激動素）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2mg/L的NAA，可誘導(dǎo)胡蘿卜生出叢芽；

在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1mg/L的NAA，可誘導(dǎo)胡蘿卜生根。結(jié)論：生長素及細(xì)胞分裂素的比例可影響細(xì)胞的脫分化及再分化。探究活動：探討影響植物細(xì)胞脫分化和再分化的因素[資料3]將外植體培養(yǎng)在黑暗條件下，10天左右即可形成高度液泡化的愈傷組織，但是若將外植體培養(yǎng)在光照條件下，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化產(chǎn)生維管束等組織，而不形成愈傷組織。結(jié)論：愈傷組織的形成需要避光。探究活動：探討影響植物細(xì)胞脫分化和再分化的因素[資料4]研究煙草組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，煙草芽的形成以28℃為好，在12℃以下，33℃以上形成率均很低。結(jié)論：脫分化及再分化都需要在適宜的溫度條件下進(jìn)行。一、培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的成分無機(jī)鹽類維生素類氨基酸有機(jī)附加物糖類水瓊脂植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)培養(yǎng)基配制程序配制母液（大量微量鐵鹽有機(jī)植物激素）加熱溶解瓊脂及糖加入各類母液定容調(diào)pH分裝滅菌選修一教材相關(guān)問題組織培養(yǎng)過程中蔗糖的吸收方式？不耐高溫的試劑如何添加到培養(yǎng)基中？為何鐵鹽母液單獨配制？為何要調(diào)整pH？選修一菊花組織培養(yǎng)中芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)基的差異？蔗糖吸收1、高壓滅菌水解2、細(xì)胞壁蔗糖酶分解3、主動吸收過濾滅菌鐵鹽母液鐵鹽母液制備：3價或2價鐵鹽分別加熱溶解后混合定容最終螯合鐵大多以三價鐵存在

。但植物細(xì)胞從EDTA吸收鐵在細(xì)胞膜上由3價鐵轉(zhuǎn)化為2價鐵。實驗一：培養(yǎng)基配置花菜花莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)基，黃瓜誘導(dǎo)愈傷及分化培養(yǎng)基1）：MS+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉，pH5.8黃瓜誘導(dǎo)愈傷及分化培養(yǎng)基2）：MS+NAA2mg/L+6-BA0.2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉，pH5.8每組配上述兩種培養(yǎng)基各800ml，每人準(zhǔn)備5支試管倒第一種培養(yǎng)基，3支試管倒第二種培養(yǎng)基。

步驟：1、在搪瓷量杯內(nèi)加入500ml去離子水。2、稱取800ml所需MS培養(yǎng)基粉劑置于搪瓷量杯中。3、加入所需植物激素母液。4、加入所需蔗糖及瓊脂。5、置于電磁爐上加熱至沸騰。6、定容至800ml。7、調(diào)節(jié)pH至5.8。8、試管分裝。9、滅菌121℃15min。植物再生植株的方式器官分化途徑胚狀體途徑試管扦插途徑外植體的成苗途徑來自于葉組織來源于根來源于維管組織來源于胚組織器官分化途徑煙草愈傷組織對不同生長素和細(xì)胞分裂素比值下不同的分化反應(yīng)外植體的成苗途徑愈傷組織來源的體細(xì)胞胚再生過程（間接體細(xì)胞胚發(fā)生）直接體細(xì)胞胚發(fā)生從一個細(xì)胞發(fā)育成一個植株雙子葉體細(xì)胞胚發(fā)育的三種形態(tài)A球形期B心形期C魚雷期試管外生根芽-芽再生節(jié)培養(yǎng)小鱗莖、小球莖的誘導(dǎo)微嫁接技術(shù)HorizontalgenometransferasanasexualpathtotheformationofnewspeciesNarure2014,Vol.511,232-236影響愈傷組織形態(tài)發(fā)生的因素浙江高考理綜2010培養(yǎng)基1）：MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂PH=5.8培養(yǎng)基2）：MS+NAA2mg/L+6-BA0.2mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂PH=5.8實驗三不同植物激素對黃瓜子葉與下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織及分化的影響一、實驗?zāi)康?.了解不同組織對相同激素配方的響應(yīng)2.了解不同激素對外植體愈傷組織及分化的影響二、實驗原理同一植物不同組織誘導(dǎo)愈傷組織及其分化受外植體來源及培養(yǎng)基配方的影響。三、實驗步驟1、在超凈臺上取無菌濾紙一張置于臺面上，打開蘭花培養(yǎng)瓶，用鑷子夾取一幼苗置于濾紙上。2、用解剖刀切下子葉上部、下部及帶子葉節(jié)的胚軸，分別接種于上述培養(yǎng)基中。子葉背面朝下，下胚軸斜插于培養(yǎng)基上。3、根據(jù)不同培養(yǎng)時間記錄不同培養(yǎng)基上上子葉、下子葉及下胚軸愈傷組織發(fā)生情況及芽誘導(dǎo)情況制表并填寫，同時拍照記錄。三、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1、植物的快速繁殖2、培育無病毒植株——選取分生組織的生長點細(xì)胞（如莖尖）3、制造人工種子——胚狀體經(jīng)特定的物質(zhì)包被4、培育作物新品種單倍體育種培育轉(zhuǎn)基因植物5、工廠化生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）是從愈傷組織的液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)，與用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物相類似，用生物反應(yīng)器進(jìn)行植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的理想狀態(tài)。CallusinductionSuspensioninitiation細(xì)胞懸浮系的建立原生質(zhì)體培養(yǎng)與植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程：以植物細(xì)胞為基本單位在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖和人為操作，改變細(xì)胞的某些生物學(xué)特性，從而改良品種加速繁育植物個體或獲得有用物質(zhì)的技術(shù)（百度百科）植物原生質(zhì)體（Protoplast）是被去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹著的、具有生活力的裸細(xì)胞。Mechanicalmethodofprotoplastisolation機(jī)械法分離原生質(zhì)體Principlestepsinenzymaticisolation酶法分離原生質(zhì)體示意圖過濾漏斗原生質(zhì)體的純化與培養(yǎng)原生質(zhì)體到細(xì)胞團(tuán)過程細(xì)胞團(tuán)到愈傷組織至完整植株細(xì)胞融合技術(shù)（原生質(zhì)體分離）通過農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)基因技術(shù)組織培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物的獲得通過生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)毛狀根冰凍種質(zhì)保存技術(shù)（懸浮細(xì)胞）1、用高度分化的植物細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行組織培養(yǎng)可以形成愈傷組織，下列敘述錯誤的是（）A該愈傷組織是細(xì)胞經(jīng)過脫分化和分裂形成的 B該愈傷組織的細(xì)胞沒有全能性C該愈傷組織是由排列疏松的薄壁細(xì)胞組成D該愈傷組織可以形成具有生根發(fā)芽能力的胚狀結(jié)構(gòu)構(gòu)習(xí)題B2、將胡蘿卜形成層的細(xì)胞培養(yǎng)成幼苗時，下列條件中不需要的是（）

A具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞 B一定的營養(yǎng)物質(zhì)和植物激素C離體狀態(tài) D導(dǎo)入特定基因習(xí)題D3、在下列選項中，沒有采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的是（）A利用秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗，得到多倍體植株B利用花藥離體培養(yǎng)得到單倍體植株C利用基因工程培育抗寒的番茄植株D利用細(xì)胞工程培育“番茄—馬鈴薯”雜種植株習(xí)題A實驗二

花菜花莖段的誘導(dǎo)教材相關(guān)問題多少酒精消毒時間合理？帶一片葉片意味著什么？菊花快繁是否一定經(jīng)歷愈傷組織階段？2015年9月浙江省新高考測試卷2015年10月浙江省選考浙江省2016年4月選考題三、試管苗馴化與移栽試管苗的生態(tài)環(huán)境高溫且恒溫高濕弱光無菌氣體環(huán)境試管苗的特點葉片解剖結(jié)構(gòu)：海綿細(xì)胞層增加而柵欄組織較差，表皮的蠟質(zhì)層減少，氣孔發(fā)育差且開關(guān)能力低下。生理：組培苗的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的含鉀量低，葉片的光合作用能力低。根系發(fā)育：一般無根毛或根毛發(fā)育極差，根系對基質(zhì)的附著能力較差。抗性：抗病能力差，易感病死亡。由于試管苗的上述特點，因此幼苗移栽入土后極易失水死亡。試管苗的馴化馴化的目的，在于提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應(yīng)性，提高其光合作用的能力，促使試管苗健壯，最終達(dá)到提高試管苗的移栽成活率。馴化的原則，應(yīng)從溫度、濕度、光照及有無菌態(tài)等環(huán)境要素進(jìn)行，馴化開始數(shù)天內(nèi)，應(yīng)和培養(yǎng)時的環(huán)境條件相似；馴化后期，則要與預(yù)計的栽培條件相似，從而達(dá)到逐步適應(yīng)的目的。盡可能采用無糖培養(yǎng)技術(shù)。被動式通氣系統(tǒng)主動式通氣系統(tǒng)涉及無糖培養(yǎng)技術(shù)的高考題2010浙江理綜鐵皮石斛移栽與馴化日常管理灌溉：1、水質(zhì)要求：如果用自來水必須提前一天接好自來水，暴曬1天，讓氯氣揮發(fā)出去。2、澆水時間：早上太陽照射前或晚上太陽照射后，最好是早上。3、澆水量：一次性澆透，直至栽培盆底持續(xù)滴水。4、澆水方式：用噴霧器霧化澆水，主要把水分澆在葉面上而不是基質(zhì)上。5、當(dāng)苗存活后，大約到2～3個月可以適當(dāng)多澆水。光照說明1、光照時間：光照時間和澆水量是相互作用的，如果基質(zhì)澆水后不容易干，要適當(dāng)增加光照時間，光照時間2～5個小時，視環(huán)境而定。2、光照環(huán)境：家庭種植最好放陽臺（可以通風(fēng)），但切記勿淋雨，陽臺配置遮陰網(wǎng)或者透明塑料膜后（遮光率在70%左右最佳）。3、環(huán)境選擇：如果不能配置遮陰網(wǎng)或者透明塑料膜，最好選擇陽光直射2-3個小時，而不是放在陰暗處。這樣有利于水分蒸發(fā)。4、人工種子植物人工種子