實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置和要求演示文稿

實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置和要求演示文稿當(dāng)前第1頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置和要求當(dāng)前第2頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)

在由中華人民共和國衛(wèi)生部辦公廳于2002年1月14日下發(fā)的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文)附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。設(shè)計根據(jù)當(dāng)前第3頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)臨床PCR診斷實(shí)驗(yàn)室設(shè)計方案工作流向?qū)Ｓ米呃犬a(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向當(dāng)前第4頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)錯誤的設(shè)計當(dāng)前第5頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。當(dāng)前第6頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。當(dāng)前第7頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)試劑準(zhǔn)備區(qū)設(shè)置要求·

超凈工作臺或試劑配置箱·

試劑冰箱·

可調(diào)移液器一套（四支），·

配有帶濾芯（防止氣溶膠）及無RNase酶的吸嘴·

無粉的乳膠手套·

渦旋器·

專用工作服·

無菌離心管·當(dāng)前第8頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆茫苊庥捎诮?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。當(dāng)前第9頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來決定。主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗(yàn)來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(shù)(在第一個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。在整個本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。當(dāng)前第10頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。當(dāng)前第11頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置要求·

生物安全柜·

樣本冰箱·

可調(diào)移液器一套（四支），·

帶濾芯（防止氣溶膠）及無RNase酶的吸嘴·

臺式微型離心機(jī)（最大RCF16000g，最小RCF12500g）；·

試管架（Sarstedt93.1428）·

無粉的乳膠手套·

渦旋器·

專用工作服·

無菌離心管·

加熱塊當(dāng)前第12頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動?？赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。當(dāng)前第13頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)用于RNA擴(kuò)增檢測的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個以上的溫育裝置。cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。待測RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。當(dāng)前第14頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)擴(kuò)增區(qū)設(shè)置要求·

CobasAmplicor·

NucliSensEasyQ·

LightCycler熒光定量PCR儀·

LightCyclerCapillaryReleaser·

專用工作服·

PCR擴(kuò)增儀當(dāng)前第15頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。不能從本區(qū)再進(jìn)入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。當(dāng)前第16頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對實(shí)驗(yàn)室臺面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。當(dāng)前第17頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)產(chǎn)物分析區(qū)設(shè)置要求·

孵箱·

洗板機(jī)·

酶標(biāo)儀·

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)·

專用工作服當(dāng)前第18頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。當(dāng)前第19頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/LHC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/LHCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。當(dāng)前第20頁\共有28頁\編于星期四\22點(diǎn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)前第21頁\