分光光度計基本原理與結(jié)構(gòu)

分光光度計基本原理與結(jié)構(gòu)1第一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無顏色的化合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質(zhì)。實踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通過比較溶液顏色深淺的方法來確定有色溶液的濃度，對溶液中所含的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。基于比較顏色深淺對溶液進(jìn)行定量分析的方法稱為比色分析法。2第二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日溶液為什么會有顏色，顏色又為什么與濃度有關(guān)呢？下面就討論這個問題。一、光的互補(bǔ)及有色物質(zhì)的顯色原理

1．光的波粒二象性光是能的一種表現(xiàn)形式，是電磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播，在不同的介質(zhì)處發(fā)生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等現(xiàn)象?？捎貌ㄩL、頻率、傳播速度等參量來描述，即光具有“波動性”。光的顏色即由光的波長決定，人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長在400～750nrn之間。在可見光之外是紅外光和紫外光。3第三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日同時，光也具有“粒子性”，光電效應(yīng)就是一個很好的例子。光的粒子性理論認(rèn)為，光是由“光子”（或稱“光量子”）所組成。在輻射能量時，光是以一份一份的能量E的形式輻射的，同時光被吸收時，能量也是一份一份被吸收的。這每一份能量的大小為hυ。光子的能量與波長的關(guān)系為

E=hυ=hc／λ

式中E為光子的能量（J：焦耳），υ為頻率，h為普朗克常數(shù)（6.63×10-34J?S），c為光速，λ為光的波長4第四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日因此，不同波長的光，其能量不同，短波能量大，長波能量小。

2。光的顯色原理若把某兩種顏色的光，按一定的強(qiáng)度比例混合，能夠得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補(bǔ)色。圖4－1中處于直線關(guān)系的兩種光為互補(bǔ)色。如綠光和紫光為互補(bǔ)色，黃光和藍(lán)光為互補(bǔ)色等等。各種溶液會呈現(xiàn)出不同的顏色，其原因是溶液中有色質(zhì)點（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實驗證明：溶液所呈現(xiàn)的顏色是其主要吸收光的互補(bǔ)色。如一束白光通過高錳酸鉀溶液時，綠光大部分被選擇吸收，其它的光透過溶液。從互補(bǔ)色示意圖可以看出，透過光中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀溶液呈紫色。5第五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日6第六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律溶液顏色的深淺與濃度之間的關(guān)系可以用吸收定律來描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結(jié)合而成的，所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計也符合這個定律。溶液對光的吸收當(dāng)一束強(qiáng)度為I的平行單色光照到溶液時，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光則透過溶液，如圖4-2所示7第七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日8第八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日有：I0=Ia+Ir+ItI0--入射光強(qiáng)度Ia--吸收光強(qiáng)度Ir--反射光強(qiáng)度It--透射光強(qiáng)度通常由于Ir很小可忽略不計，上式可簡化為

I0=Ia+It透射光It與入射光強(qiáng)度I0之比為透光率或透光度，用T表示：

T=It/Ia透光率的負(fù)對數(shù)稱為吸光度或光密度或消光度，用A表示：

A=－lgT=lg1/T=lgIa/It9第九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日吸光度越大，表示該物質(zhì)對光的吸收越強(qiáng)。透光度和吸光度都是用來表示入射光被吸收的程度，它們之間可據(jù)式相互換算。實驗證明，單色光經(jīng)過有色溶液時，透過溶液的光強(qiáng)度不僅與溶液的濃度有關(guān)，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對光的吸收性能有關(guān)。其規(guī)律可用下式表示為

A＝KCL

式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；

K——某溶液的消光（吸收）系數(shù)；

C——溶液的濃度；

L——光程，即溶液的厚度。10第十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日消光系數(shù)K是一個常數(shù)。一種有色溶液對于一定波長（單色光）的入射光的K值具有一定的數(shù)值。若溶液的濃度以摩爾／升表示，溶液厚度以厘米表示，則此時的K值稱為摩爾消光系數(shù)。摩爾消光系數(shù)是有色化合物的重要特性之一，根據(jù)這個數(shù)值的大小，可以估計顯色反應(yīng)的靈敏程度。從上式可以看出，當(dāng)K和L不變時，光密度E與溶液濃度C成正比關(guān)系，也可以說，當(dāng)一束單色入射光經(jīng)過有色溶液且入射光、消光系數(shù)和溶液厚度不變時，吸光度A是隨著溶液濃度而變化的。11第十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日這種單色光與有色溶液的關(guān)系稱為朗伯-比爾定律。光電比色計和分光光度計的比色分析方法就是根據(jù)這一定律來進(jìn)行的。但是，朗伯-比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。三、朗伯-比爾定律的應(yīng)用

1．等吸光度法從朗伯-比耳定律可知，當(dāng)用同一光源照射同一物質(zhì)的不同濃度溶液時，若吸光度相等，則兩溶液各自的濃度和透光液層厚度的乘積也相等。利用此關(guān)系在可見光區(qū)用眼作檢測器（目視比色法），即可求出待測溶液的濃度。12第十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日

2．計算法根據(jù)被測溶液濃度的大致范圍，先配制一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測溶液，使其成色后，在同樣的實驗條件下用同一臺儀器分別測定它們的吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)溶液中：As=KsCsLs

在待測溶液中：Ax=KxCxLx

如果測定時選用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波長的單色光，保持溫度相同，則K也相等。將兩式相除可得

As/Ax=Cs/Cx13第十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日由此可見，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設(shè)計一種儀器，可以測量吸光度A值，則待測溶液的濃度即可求出

Cx=Ax/As?Cs

由于儀器的性能和實驗環(huán)境在不斷的變化，所以在采用計算法時，必須每次都要對標(biāo)準(zhǔn)液和被測液進(jìn)行測量，然后利用上式進(jìn)行計算，否則會帶來較大的測量誤差。由于一般光電比色計在結(jié)構(gòu)上有不少偏離朗伯一比耳定律的地方，故欲得到較準(zhǔn)確的結(jié)果，常采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。14第十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日3．標(biāo)準(zhǔn)曲線法這種方法分以下幾步：（1）先配制五種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液。（2）測出每種溶液的吸光度A。（3）做A～C標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖4－3所示。有了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線便可對溶液進(jìn)行測量。在同樣的條件下，用儀器測出A后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得被測溶液的濃度值Cx。15第十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日16第十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日由于光電比色計工作在可見光區(qū)，只適合在有限個波長下測量，且波長的半寬度大。因此，它不能滿足不同分析工作的需要。其次，光電比色計的靈敏度也低。為了克服以上不足，便發(fā)展了性能更好的分析方法：紫外--分光光度法。它利用單色器分光，其單色光純度高，波長范圍寬，并可連續(xù)變化，解決了光電比色計存在的問題。17第十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日一、分光光度計基本原理和結(jié)構(gòu)分子，包括雙原子分子的光譜，要比原子光譜復(fù)雜得多。這是由于在分子中，除了電子相對于原子核的運(yùn)動外，還有核間相對位移引起的振動和轉(zhuǎn)動。這三種運(yùn)動能量都是量子化的，并對應(yīng)有一定的能級。分子的總能量可以認(rèn)為是這三種能量的總和，即

E=E。＋E振＋E轉(zhuǎn)18第十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日當(dāng)用頻率為υ的電磁波照射分子，而該分子的較高能級與較低能級之差⊿E恰好等于該電磁波的能量hυ時，即有⊿E=hυ這里，h為普朗克常數(shù)。此時，在微觀上出現(xiàn)分子由較低的能級躍遷到較高的能級，在宏觀上則表現(xiàn)為透射光的強(qiáng)度變小。若用一連續(xù)輻射的電磁波照射分子，將照射前后光強(qiáng)度的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，并記錄下來，就可以得到一張光?qiáng)度變化對波長的關(guān)系曲線圖——分子吸收光譜圖。19第十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日紫外--可見區(qū)的分子吸收光譜一般是譜帶較寬的帶狀光譜，它是由于電子能級躍遷而產(chǎn)生的光譜，因此又叫做電子光譜。分子吸收光譜與物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，吸光度的大小與物質(zhì)的含量有關(guān)，我們利用吸收光譜的形狀和吸收程度的大小即可對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。這種分析方法叫做分光光度法。二、分光光度計的基本結(jié)構(gòu)與光電比色計相比，在結(jié)構(gòu)上分光光度計用單色器代替了濾光片，其它部分兩者比較相似。20第二十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日（－）單色器：單色器是指一個光學(xué)系統(tǒng)，它比濾光片能更有效地提供帶寬窄的單色光。單色器的主要組件是玻璃棱鏡、復(fù)合濾光片或光柵。來自光源的光線，可直接通過單色器的狹縫，照到分光部件上。單色器的效率比普通濾光片高。在紫外和可見光范圍內(nèi)，半寬度不超過1nm。

1．棱鏡單色器從幾何光學(xué)我們知道，當(dāng)一束光從一種介質(zhì)射到另一種介質(zhì)時，在界面會發(fā)生折射和反射，如圖4-3所示。設(shè)入射角為i，折射角為θ，則其折射率n為:n=Sini/sinθ21第二十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日不同的光學(xué)材料具有不同的折射率，這是眾所周知的。即使使用同一種光學(xué)材料，以相同的人射角照射，若波長不同，得到的折射角也不一樣。透明物質(zhì)的折射率n和入射光波長的關(guān)系可以用下列經(jīng)驗式表示：n＝A＋B/λ2＋C/λ4＋…式中A、B、C的數(shù)值與物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。從式中可以看出，波長越長，折射率越小。一束復(fù)合光進(jìn)入棱鏡，由于不同波長的光，其折射率不同，通過棱鏡后，復(fù)色光就按不同的波長分開來了，如圖4－4所示。22第二十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日23第二十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日實驗證明，棱鏡的色散具有非線性，即①譜線彎曲；②不同波長區(qū)域色散效果不同，紅端色散差，紫端色散較好。雖然在實際應(yīng)用中的棱鏡單色器與圖示的不盡相同，然而它們的工作原理是一樣的。

2．光柵單色器衍射光柵也可用作單色器。衍射光柵是由一系列刻劃在高光潔度反射表面上溝紋組成的。溝紋排列異常密集，每英寸長度上有15000或30000條。將光柵放在一平行光束里，光柵的一面被照亮，這一面可看作是塊非常小的反射鏡。24第二十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日從溝紋反射鏡反射出的光線相重疊，發(fā)生干涉，如圖4－5所示。另一方面，如果在光線方向上的溝紋條數(shù)是波長的整數(shù)倍時，光線就被溝紋分開，這種波就是同向的，射線被反射。當(dāng)它不是波長的整數(shù)倍時，光線被抵消，沒有反射現(xiàn)象。改變光線照到光柵上的角度，就可以改變反射光的波長。射線波長λ與反射角θ的關(guān)系，如下式：

mλ=2dsinθ

式中，d是溝紋之間的距離，θ是光柵常數(shù)；m是干涉價數(shù)。當(dāng)m=1時，為一階譜；m=2時，為二階譜。25第二十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日光柵的分辨能力取決于它的mN值，N是光柵上總溝紋數(shù)或總條數(shù)。條數(shù)多時，一階譜的分辨力高。與棱鏡相比，光柵的分辨能力更高些，并能用于所有譜段范圍，光柵的色散呈線性。26第二十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日27第二十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日光柵的表面鍍有鋁膜，質(zhì)地松軟，極易擦傷。所以在維護(hù)時嚴(yán)禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去觸摸，否則，會造成永久損壞。也不準(zhǔn)用嘴去吹光柵上的灰塵。光柵萬一臟了，可以用洗耳球吹去表面上的灰塵。如不奏效，可以在光柵上均勻地涂上一層粘膠棉（俗稱火棉膠）液，等膠液干了以后，將液膜輕輕揭下。此法可以將光柵上的臟物去掉?，F(xiàn)在有的光柵已鍍有保護(hù)膜。28第二十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日（二）準(zhǔn)直鏡和聚光鏡：準(zhǔn)直鏡用來減小光束的尺寸并提供平行光，其多由凹面鏡制成。凹面鏡的反射鏡面大都是鍍鋁的。在可見光區(qū)，鋁膜外面常常再鍍上一層SiO2保護(hù)層。但在紫外區(qū)，為了保證較高的反射效率。常常不鍍此SiO2保護(hù)膜，這種準(zhǔn)直鏡的維護(hù)方法與光柵相同。聚光鏡為一凸透鏡。點光源發(fā)出的光，經(jīng)聚光鏡后，變成平行光，然后再進(jìn)入棱鏡（或光柵）色散系統(tǒng)。色散后的平行光再經(jīng)聚光鏡會聚后，照射到比色皿上。29第二十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日三、分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)簡介分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)有許多類型，不同類型的光學(xué)系統(tǒng)，對測量方法和結(jié)果都有一定影響，下面，我們介紹幾種常用分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)。（－）單光束光學(xué)系統(tǒng)：它是分光光度計中最簡單的和應(yīng)用最普遍的一種。它的特點是只有一條光束。通過交換參比和樣品的位置，使其分別進(jìn)入光路。在參比（溶劑）進(jìn)入光路時，調(diào)零。然后將樣品進(jìn)入光路的信號和參比信號進(jìn)行比較，就可在顯示器上讀出樣品的透過率和吸光度。結(jié)構(gòu)如圖4－6所示。30第三十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日31第三十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日單光束分光光度計由于在每個波長都需要變換參比和樣品的位置，所以只能手動，不能掃描吸收光譜。它的結(jié)構(gòu)比較簡單，使用也有一定限制，但如配置程序控制和打印裝置，則對一些常規(guī)的定量測定（如醫(yī)院化驗室）還是比較適用的。國產(chǎn)754型、WFD－SA型、WFZ800D型分光光度計，以及國外的貝克曼DU型、島津QC－50、QR－50、日立EPU－2A型、希爾格H700型、C－4型等都屬于這種類型的儀器。32第三十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日（二）雙光束光學(xué)系統(tǒng)：單光束分光光度計雖簡單價廉，但有如下缺陷：即它要求在整個測定過程中光源必須穩(wěn)定不變；另外光電轉(zhuǎn)換器和放大器如有不規(guī)則的特性會給測量結(jié)果帶來誤差。為克服上述缺點，設(shè)計了雙光束分光光度計。其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4-7所示。33第三十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日34第三十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日雙光束分光光度計的光路設(shè)計基本與單光束相似。差別在于雙光束分光光度計的單色器的出射狹縫和樣品室之間加了一個光束分裂器或斬波器，它的作用是以一定頻率把一個光束交替分成兩路。使一路經(jīng)過參比溶液，另一路經(jīng)過樣品溶液，然后由一個檢測器交替接收（或兩個匹配檢測器分別接收）參比信號和樣品信號。接收的光信號轉(zhuǎn)變成電信號后，由前置放大器放大，最后由顯示系統(tǒng)顯示透光度或吸光度。為了保持參考光路在不同的波長有恒定光電流輸出，常采用兩種設(shè)計方法：35第三十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日一種是采用光電倍增管，電壓恒定，但狹縫寬度隨波長而變化；另一種是采用狹縫寬度恒定，但光電倍增管電壓隨波長而變化。后者便于在相同測定條件下對一些數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，雙光束方式測定程序大大簡化，不僅可直接讀數(shù)、記錄結(jié)果和數(shù)字顯示，而且可進(jìn)行“全波段自動掃描”，實現(xiàn)自動化分析，直接打印出分析結(jié)果，再加上附件的設(shè)置，更加擴(kuò)展了它的使用范圍。因此雙光束分光光度計發(fā)展很快，使用更加普遍，比單光束分光光度計要優(yōu)越得多。36第三十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日雙光束分光光度計種類很多，大致可分為中低檔和高檔兩類。中低檔的如上海第三分析儀器廠的710型（自動記錄）、730型（數(shù)字顯示）、740型。日本島津公司的UV－260，日立公司的U－1000/2000，Unicam公司的Pu-8600型，Varian公司的DMS系列，Perkin－elmer公司的3、15、17型等。高檔的一般都采用微機(jī)控制操作和處理數(shù)據(jù)，既可記錄、打印，又有屏幕顯示。且大多采用雙單色器，使分辨率提高，雜散光減少．此種類型的儀器如Perkin－Elmer公司的Lambda－9型，Beckman公司的DU60、70型，PyE－Unicam公司的Pu－8800型，島津公司的UV－265型，日立公司的U－3200／U－3400型，Varian公司的2200／2300系列等。37第三十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日（三）雙波長／雙光束分光光度計：由于單、雙光束分光光度計都不能克服因非特征吸收信號（如試液混濁引起的散射，比色皿-空氣界面與比色皿-溶液界面的折射差別等）的影響而帶來測量中的誤差。為此提出了雙波長測定法，用雙波長分光光度計來測定高濃度試樣的混濁試樣以及多組分混合物的定量分析具有很大的優(yōu)越性，提高了靈敏度和準(zhǔn)確度。Chance實驗室在1951年首先設(shè)計了世界上第一臺雙波長分光光度計。以后Aminco-Bow-man公司、日立公司和島津公司等先后研制設(shè)計了各種類型的雙波長分光光度計，如156型、365型、556型和557型；UV300型、UV-3000型等。38第三十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日39第三十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日從圖4－8可知雙波長分光光度計的基本原理是：從同一個光源發(fā)出的光分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束具有不同波長（λ1和λ2）的單色光，利用切光器使這兩束光以一定的時間間隔交替地照射到同一個試樣池。經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，在記錄器上顯示出兩束光（λ1和λ2）的吸光度差⊿A，即⊿A=Aλ1－Aλ。只要λ1和λ2選擇得適當(dāng)（被測物在一個波長上有最大吸收峰，在另一個波長上則不吸收或很少吸收；而非檢測物對兩種波長的吸收是相同的），⊿A就為消除了非特征吸收影響（或稱扣除了“背景吸收”）的吸光度。40第四十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日41第四十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期日如圖4－9所示，設(shè)在雙波長測定中，入射到試樣池的兩束光強(qiáng)度相同，對應(yīng)波長分別為λ1和λ2，其中AS為背景吸收，則有