藥劑學(xué)課件第二十二章 生物技術(shù)藥物制劑

1第二十二章

生物技術(shù)藥物制劑2內(nèi)容提要生物技術(shù)藥物如蛋白質(zhì)、多肽和抗體等新藥的數(shù)量不斷上升，且在重磅藥物（blockbusterdrugs）中占很大比重。生物技術(shù)藥物特異性強(qiáng)，藥效高，副作用小。生物技術(shù)藥物分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，親水性強(qiáng)和解離特性難以透過(guò)生物膜，且血漿半衰期短，多采用一日多次注射的給藥方式。3內(nèi)容要求掌握生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)；熟悉蛋白多肽類藥物的結(jié)構(gòu)及其不穩(wěn)定性。了解蛋白多肽類藥物的新型給藥系統(tǒng)。4第一節(jié)概述生物技術(shù)（Biotechnology）是應(yīng)用生物體（包括微生物、動(dòng)植物細(xì)胞）或其組成部分（細(xì)胞器和酶），在最適條件下，生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)物或進(jìn)行有益過(guò)程的技術(shù)。現(xiàn)代生物技術(shù)主要包括：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程、蛋白質(zhì)工程、抗體工程等。第一節(jié) 概述5生物技術(shù)藥物（Biotechdrugs）是指利用現(xiàn)代生物技術(shù)（如基因工程、細(xì)胞工程、抗體工程等）制備的蛋白質(zhì)、多肽或核酸類藥物。生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)：分子靶向性、藥理活性強(qiáng)、劑量小穩(wěn)定性差口服吸收差半衰期短生物技術(shù)藥物生物技術(shù)藥物的發(fā)展1982年,重組人胰島素上市1998年,65個(gè)生物藥物上市，2600個(gè)進(jìn)入臨床前，700多個(gè)進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，200多種進(jìn)入III期臨床分子生物學(xué)和生物技術(shù)快速發(fā)展，2000年后生物技術(shù)藥物新藥獲批數(shù)量增加67重磅藥物（blockbusterdrugs）藥品名稱適應(yīng)癥銷售額（10b/2012）Adalimu

mab（阿達(dá)木單抗）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎9.27Inflixi

mab（英夫利昔單抗）銀屑病、強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎8.22Etanercept（依那西普）自身免疫疾病7.96fluticasone哮喘、肺氣腫7.90Rituxi

mab（利妥昔單抗）淋巴瘤、白血病、器官移植排斥6.65Insulin

glargine（甘精胰島素）糖料病6.40Trastuzu

mab（曲妥珠單抗）乳腺癌6.25Rosuvastatin搞膽固醇血癥、心血管疾病6.26Bevacizu

mab(貝伐珠單抗）各種癌癥5.38生物藥物制劑開發(fā)面臨的挑戰(zhàn)分子量大、親水性，導(dǎo)致其膜通透性差，大部分采用注射給藥，以保證生物利用度。半衰期短，頻繁給藥，病人順應(yīng)性差。結(jié)構(gòu)復(fù)雜，藥物穩(wěn)定性差（聚集、構(gòu)象），制備、貯藏難度大。在胃腸道中容易酶、pH影響，容易失活。非注射給藥的制劑開發(fā)尚未開發(fā)成功。89生物技術(shù)藥物制劑戈舍瑞林可注射埋植劑降鈣素溶液注射劑胸腺肽凍干粉注射劑環(huán)孢素A自乳化軟膠囊10第二節(jié)蛋白和多肽類藥物制劑蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)：

一級(jí)結(jié)構(gòu)：為初級(jí)結(jié)構(gòu)，指蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸排列順序，包括肽鏈數(shù)目和二硫鍵位置。高級(jí)結(jié)構(gòu)：二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)為高級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)和二硫鍵與蛋白質(zhì)的生物活性有重要關(guān)系。一、蛋白多肽類藥物的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)11蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序排列，通過(guò)肽鍵相連而成的多肽鏈。蛋白質(zhì)分子量很大，一般在5×103--5×106。蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)包括氨基酸組成、氨基酸排列順序、肽鏈數(shù)目、末端組成和二硫鍵的位置等。12二級(jí)結(jié)構(gòu)：指多肽鏈骨架的折疊方式，即肽鏈主鏈有規(guī)律的空間排布，一般有α螺旋結(jié)構(gòu)與β折疊形式。三級(jí)結(jié)構(gòu)：指已折疊的肽鏈在分子中的空間構(gòu)型，系一條多肽鏈中所有原子的空間排部。四級(jí)結(jié)構(gòu)：指具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的各亞基聚合而成的大分子蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)13蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)旋光性紫外吸收蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)14（1）旋光性蛋白質(zhì)分子總體旋光性由構(gòu)成氨基酸各個(gè)旋光度的總和決定，通常是右旋，它由螺旋結(jié)構(gòu)引起。蛋白質(zhì)變性，螺旋結(jié)構(gòu)松開，則其左旋性增大。（2）紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶苯核的苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm顯示強(qiáng)吸收。15（3）蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)蛋白質(zhì)除了肽鏈N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的側(cè)鏈上還有很多解離基團(tuán)，如賴氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。這些基團(tuán)在一定pH條件下都能發(fā)生解離而帶電。因此蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同pH條件下蛋白質(zhì)會(huì)解離成陽(yáng)離子或陰離子。16二、蛋白質(zhì)和多肽類藥物的穩(wěn)定性（一）化學(xué)穩(wěn)定性

脫酰胺化水解氧化二硫鍵斷裂及重排其他17例如：蛋白多肽中天冬酰胺側(cè)鏈酰胺攻擊肽鍵，形成丁二酰亞胺，進(jìn)一步水解，發(fā)生脫酰胺化。化學(xué)穩(wěn)定性--脫酰胺化18蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)可被酸、堿和蛋白酶催化水解，使蛋白質(zhì)分子斷裂，分子量逐漸變小，成為分子量大小不等的肽段和氨基酸。蛋白質(zhì)的氧化序列中有可能參與氧化的氨基酸可以在一些氧化劑的作用下氧化(如甲硫氨酸氧化成亞砜)，使一些多肽類激素和蛋白質(zhì)失去活性?；瘜W(xué)穩(wěn)定性19二硫鍵斷裂及重排二硫鍵對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象起重要作用。在某些蛋白質(zhì)中，二硫鍵一旦破壞，蛋白質(zhì)的生物活性即喪失。其他：外消旋作用當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)用堿水解時(shí)往往會(huì)使某些氨基酸產(chǎn)生消旋作用。消旋作用一般能使氨基酸成為非代謝的形式20（2）物理穩(wěn)定性聚集（aggregation)，宏觀沉淀，和表面吸附導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，這些都是由于與空間構(gòu)象有關(guān)的非共價(jià)鍵引起。包括非共價(jià)的靜電力，氫鍵，疏水鍵的相互作用以及蛋白質(zhì)的水化。溫度、pH、離子強(qiáng)度等影響穩(wěn)定性21（三）蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的分析方法液相色譜法:評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的純度與穩(wěn)定性;常用RP-HPLC、IEC與SEC。光譜法:通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)吸收、輻射、散射光的定量分析可以了解蛋白質(zhì)的量、構(gòu)象和聚集傾向。常用紫外、可見吸收光譜、旋光色散、圓二色譜、熒光、紅外和拉曼光譜。電泳:可分離混合蛋白質(zhì);常用SDS、IEF和CE生物活性測(cè)定與免疫測(cè)定22三、蛋白質(zhì)類藥物制劑的處方與工藝（一）蛋白質(zhì)類藥物的一般處方組成蛋白質(zhì)類藥物注射劑的分類：溶液型注射劑：使用方便，但需在低溫（2-8°C）下保存。粉針：比較穩(wěn)定，但工藝較為復(fù)雜。23（二）液體劑型中蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定化在液體劑型中蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定化方法分為兩類：①改造其結(jié)構(gòu)；②加入適宜輔料。蛋白類藥物的穩(wěn)定劑有以下幾類：

1.緩沖液

2.表面活性劑6.大分子化合物

3.糖和多元醇7.組氨酸、甘氨酸、

4.鹽類賴氨酸的鹽酸鹽等

5.聚乙二醇8.金屬離子24緩沖液pH對(duì)多肽、蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性和溶解度均有重要的影響。在較強(qiáng)的酸、堿性條件下多肽、蛋白質(zhì)藥物容易發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，在不同的pH條件下多肽、蛋白質(zhì)藥物還可發(fā)生構(gòu)象的可逆或不可逆改變(聚集、沉淀、吸附或變性)多肽、蛋白質(zhì)藥物在pH4-10的范圍內(nèi)是比較穩(wěn)定的。常用磷酸鹽緩沖液,枸櫞酸鹽緩沖液25表面活性劑含長(zhǎng)鏈脂肪酸的表面活性劑或離子型的表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉等)可引起蛋白質(zhì)的解離或變性。少量的非離子型的表面活性劑(主要是聚山梨酯類)具有防止蛋白質(zhì)聚集的作用?？赡艿臋C(jī)理是表面活性劑傾向性地分布于氣／液或液／液界面，防止蛋白質(zhì)在界面的變性等。26鹽類無(wú)機(jī)離子可能夠提高蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，也可能降低蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，取決于鹽的種類、濃度、離子相互作用的性質(zhì)及蛋白質(zhì)的電荷。在多肽、蛋白質(zhì)藥物的溶液型注射劑中常用的鹽類有NaCl和KCl等。27（三）蛋白質(zhì)藥物凍干制劑的穩(wěn)定性與工藝在一些蛋白質(zhì)藥物不能采用溶液型制劑時(shí)，往往用冷凍干燥與噴霧干燥的工藝解決這類制劑的穩(wěn)定性問(wèn)題，這兩種工藝均可用于蛋白類藥物的脫水以延緩溶液中常見的分解作用。凍干制劑為不定形粉末的餅狀物時(shí)，往往含水量適當(dāng)，加水時(shí)溶解迅速而且澄清度好。28冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑冷凍干燥制備蛋白質(zhì)類藥物制劑主要考慮兩個(gè)問(wèn)題：選擇適宜的輔料，優(yōu)化蛋白質(zhì)藥物在干燥狀態(tài)下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性?？紤]輔料對(duì)冷凍干燥過(guò)程一些參數(shù)的影響，如最高與最低干燥溫度，干燥時(shí)間，冷凍干燥產(chǎn)品的外觀等。29蛋白質(zhì)藥物在凍干過(guò)程中可能失去活性的原因:從液態(tài)到固態(tài)的相變過(guò)程中，包在蛋白質(zhì)周圍的水分子被除去而失活；高濃度的鹽和緩沖組分的結(jié)晶或緩沖液pKa對(duì)溫度敏感而導(dǎo)致pH變化、濃縮時(shí)蛋白質(zhì)有限的溶解度等均能導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物失活。在選擇凍干制劑的緩沖體系時(shí)，要考慮到溫度對(duì)pH值和溶解度的影響。30冷凍干燥注意事項(xiàng)凍干保護(hù)劑:可改善產(chǎn)品的外觀和穩(wěn)定性，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐等。預(yù)凍:一般應(yīng)盡快將溫度降至Tg以下;含水量:過(guò)多會(huì)影響藥物穩(wěn)定性或引起制劑的塌陷；而干燥過(guò)度可能使多肽、蛋白質(zhì)藥物的極性基團(tuán)暴露(一般認(rèn)為蛋白質(zhì)分子被單層水分子包圍時(shí)最穩(wěn)定)，因此應(yīng)加以控制(一般在3％左右)。31（二）噴霧干燥蛋白質(zhì)藥物制劑噴霧干燥的特點(diǎn)是所得產(chǎn)品可以控制顆粒大小與形狀，生產(chǎn)出流動(dòng)性很好的球狀顆粒此項(xiàng)工藝對(duì)制備蛋白質(zhì)類藥物的控釋制劑特別是發(fā)展新的給藥系統(tǒng)是很有用的。在噴霧干燥過(guò)程中也可加入穩(wěn)定劑。噴霧干燥的缺點(diǎn)是操作過(guò)程中損失大，特別是小規(guī)模生產(chǎn)，水分含量高。32四、蛋白質(zhì)類藥物新型的給藥系統(tǒng)應(yīng)用的生物可降解材料有聚乳酸（PLA）或聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA），改變丙交酯與乙交酯的比例或分子量，可得到不同時(shí)間生物降解性質(zhì)的緩釋微球。通過(guò)控制蛋白質(zhì)進(jìn)入血流的釋放速度，從而達(dá)到延長(zhǎng)蛋白質(zhì)類藥物血漿半衰期的目的。（一）緩釋微球制劑33部分已上市緩釋微球注射劑

藥物/商品名制劑生產(chǎn)廠家曲普瑞林tiptorelin(Decapeptyl達(dá)必佳)微球德國(guó)FERRING戈舍瑞林goserelin(Zoladex)微球英國(guó)ZENICA亮丙瑞林leuprorelin(Enantone抑那通)微球日本武田生長(zhǎng)激素somatropin微球美國(guó)ALMES促黃體激素釋放因子的類似物，這類長(zhǎng)效注射劑用于治療子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤、性早熟及前列腺癌、乳腺癌等激素依賴性疾病。常規(guī)注射劑需每日給藥，一個(gè)治療周期約為3～6月；而微球注射劑在體內(nèi)可緩釋藥物達(dá)1個(gè)月，至數(shù)月時(shí)間。

34復(fù)乳液中干燥法低溫噴霧提取法噴霧干燥法超臨界萃取法常用于制備多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子藥物微球的方法：35一些疫苗全程免疫至少進(jìn)行三次接種，才能確證免疫效果，但目前輟種率達(dá)70%。為了提高免疫接種的覆蓋率，減少一些重大疾病的死亡率，世界衛(wèi)生組織提出項(xiàng)目：疫苗脈沖式給藥系統(tǒng)。疫苗脈沖式給藥系統(tǒng)的目標(biāo)：一次注射該制劑在1-14天，1-2月與9-12月分三次釋藥。(二)脈沖式給藥制劑36（三）非注射給藥給藥制劑蛋白質(zhì)和多肽類藥物非注射途徑包括鼻腔、口服、直腸、口腔、透皮、眼內(nèi)和肺部給藥，其中鼻腔似乎最有前景，蛋白質(zhì)類藥物非注射途經(jīng)系統(tǒng)存在的主要問(wèn)題是藥物穿透粘膜能力差，易受酶的降解，以至生物利用度很低。37為了提高這類藥物制劑的生物利用度，一般采用以下方法：

(1)對(duì)藥物進(jìn)行化學(xué)修飾或制成前體藥物；

(2)應(yīng)用吸收促進(jìn)劑；

(3)使用酶抑制劑；

(4)采用離子電滲法皮膚給藥。

38吸收促進(jìn)劑作用機(jī)制：(1)增強(qiáng)藥物的熱力學(xué)運(yùn)動(dòng)，使藥物不易聚集，溶解性增加，易于吸收；(2)改變上皮細(xì)胞的體積，使細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)更易進(jìn)行；(3)增加生物膜的流動(dòng)性，使藥物容易穿過(guò)，或引起膜磷酯排列的混亂或是促進(jìn)膜中蛋白的瀝濾；(4)抑制藥物的水解。39鼻腔給藥系統(tǒng)鼻腔粘膜中動(dòng)靜脈和毛細(xì)淋巴管分布十分豐富鼻腔呼吸區(qū)細(xì)胞表面具有大量微小絨毛鼻腔粘膜的穿透性較高而酶相對(duì)較少提高蛋白質(zhì)類藥物鼻腔給藥的生物利用度，可采用吸收促進(jìn)劑。40口服給藥系統(tǒng)蛋白質(zhì)類口服給藥主要存在的問(wèn)題：

(1)在胃內(nèi)酸催化降解；

(2)在胃腸道內(nèi)的酶水解；

(3)對(duì)胃腸道粘膜的透過(guò)性差；

(4)在肝的首過(guò)效應(yīng)。41蛋白質(zhì)類口服給藥主要?jiǎng)┬停?/p>

微乳制劑；納米囊；腸溶軟膠囊；微球制劑；脂質(zhì)體等。42直腸給藥系統(tǒng)直腸內(nèi)水解酶活性比胃腸道低pH接近中性藥物吸收后可避免肝的首過(guò)效應(yīng)。43口腔粘膜給藥系統(tǒng)口腔粘膜較鼻腔粘膜厚，但無(wú)角質(zhì)層面頰部血管豐富，藥物吸收后可經(jīng)頸靜脈、上腔靜脈直接進(jìn)入全身避免胃腸消化液降解和肝的首過(guò)效應(yīng)44經(jīng)皮給藥系統(tǒng)皮膚的穿透性低是多肽和蛋白質(zhì)藥物經(jīng)皮吸收的主要障礙，但皮膚的水解酶活性相當(dāng)?shù)?，為多肽和蛋白質(zhì)藥物經(jīng)皮吸收創(chuàng)造了有利條件。離子導(dǎo)入技術(shù)使大分子量、荷電和親水性的多肽和蛋白質(zhì)類藥物能透過(guò)皮膚角質(zhì)層。45肺部給藥系統(tǒng)目前肺部給藥系統(tǒng)存在的主要問(wèn)題：

(1)長(zhǎng)期給藥后安全性評(píng)估；

(2)肺吸收分子大小的限制；

(3)促進(jìn)吸收的措施；

(4)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物的處方設(shè)計(jì)等。46五、蛋白質(zhì)類藥物制劑的評(píng)價(jià)制劑中藥物的含量測(cè)定；紫外分光光度法反相高效液相色譜法制劑中藥物的活性測(cè)定；酶連免疫法放射免疫測(cè)定法47制劑中藥物的體外釋藥速率測(cè)定；考慮到藥物在溶出介質(zhì)中不穩(wěn)定，多采用測(cè)定制劑中未釋放藥物量的方法制劑的穩(wěn)定性研究；物理穩(wěn)定性：聚集化學(xué)穩(wěn)定性：降解生物穩(wěn)定性：生物活性測(cè)定。

48體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究；放射標(biāo)記法測(cè)定血漿中藥物的量反相高效液相色譜法刺激性和生物相容性研究；皮膚、粘膜及各類腔道用藥需進(jìn)行局部毒性和刺激性試驗(yàn)，各類注射（植入）途徑給藥劑型除進(jìn)行局部毒性和刺激性試驗(yàn)外還需進(jìn)行所用輔料的生物相容性研究，49生物技術(shù)藥物：是指利用生物技術(shù)制備的藥物。生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)：分子靶向性、藥理活性強(qiáng)、劑量小、穩(wěn)定性差、口服吸收差、半衰期短穩(wěn)定性：化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性穩(wěn)定化措施：磁改造其結(jié)構(gòu)、加入適宜輔料總結(jié)50名詞解釋（20分）選擇題（20分）簡(jiǎn)答題（30