藥分課件 第六章 常用分子生物學技術的原理及其應用

常用分子生物學技術的原理及應用金晶中山大學藥學院第六章第一節(jié)分子雜交與印跡技術MolecularHybridizationandBlottingTechnique分子雜交技術利用單鏈核酸堿基互補配對、抗原與抗體、受體與配體、蛋白與其他分子的相互作用進行目的核酸、蛋白質檢測，廣泛應用于基因重組、生物印跡示蹤、生物芯片等領域，具有高特異性、高靈敏度、高通量等特點的技術。（一）核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術的原理DNA的變性、復性DNA變性是指DNA雙螺旋結構解開，氫鍵斷裂，但并不涉及核苷酸間磷酸二酯鍵的斷裂。變性DNA在適當條件下，又可使兩條彼此分離的鏈重新締合而形成雙螺旋結構，這一過程稱為復性或退火。復性后的DNA可基本恢復一系列的理化性質，生物學活性也可得到部分恢復。DenaturationandrenaturationofDNA導致DNA變性的因素高溫酸堿有機溶劑:乙醇、尿素、甲酰胺等DNA變性后物理性質發(fā)生了變化：粘度下降，沉降速度增加提高了對紫外線的吸收能力：增色效應游離堿基或核苷酸的A260:1.60單鏈DNA的A260:1.37雙鏈DNA的A260：1.0（濃度為50μg/mL時測定）增色效應：指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。產(chǎn)生增色效應的原因：DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結構中堿基藏入內側，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應。

A260/A280反映核酸的純度純DNA：比值為1.8,(實驗時1.6<比值<1.9)純RNA：比值為2.0，(實驗時1.7<比值<2.0)Tm（meltingtemperature）：解鏈溫度，A260升高到一半時的溫度。生理條件下Tm一般為85～95℃之間。DNA復性對片段有兩個要求

1、互補序列的碰撞和排列

2、堿基的正確排列和氫鍵的形成核酸分子雜交示意圖復性RNADNA（二）印跡技術利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（三）探針技術二、印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡

(SouthernBlotting)（二）RNA印跡(NorthernBlotting)（三）蛋白質的印跡

(WesternBlotting)用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。其他：斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)DNA芯片技術(DNAchip)三種印跡技術的比較分子雜交實驗①②③放射自顯影照片Biochip（生物芯片）定義：在斑點雜交基礎上，模擬制備大規(guī)模集成電路的基本原理，集成了探針原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦顯微技術發(fā)展來的一門分子生物學技術原理：將大量樣本固定于較小的支持物上，然后與標記好的待測樣品雜交，再檢測雜交信號的強弱，從而判斷樣本中待測DNA、RNA、Pr等分子數(shù)量或活性狀態(tài)特點：高通量、微型化、集約化、標準化等基因芯片(genechip)DNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上?；蛐酒?genechip)基因芯片(Genechip)技術是指:通過微陣列(Microarray)技術將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術Biochip（生物芯片）應用基因表達水平的檢測基因診斷藥物篩選個體化醫(yī)療測序生物信息學研究Biochip（生物芯片）DNA點陣第二節(jié)聚合酶鏈反應PolymeraseChainReactionPCR技術簡史PCR的原理PCR的反應體系和方法PCR的類型和應用PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了……PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學檢測人類學研究……基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段94℃變性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA引物設計：（1)序列應位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布，G+C占50-60%。（4）引物內部避免形成二級結構。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關鍵堿基；5’端無嚴格限制。3’5’3’5’限制性內切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記1）PCR反應成分（1）模板

單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。PCR反應條件（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chǎn)量。（4）dNTP

dNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。（3）延伸

70-75oC，延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉錄反應相結合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。二、PCR技術的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技術可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。PCR技術高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變將PCR技術引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析逆轉錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉錄反應和PCR反應聯(lián)合應用的一種技術。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉錄PCR技術三、幾種重要的PCR衍生技術原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內進行的PCR反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。原位PCR方法彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術（三）實時PCR技術實時PCR(real-timePCR)技術通過動態(tài)監(jiān)測反應過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。實時PCR技術原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標記引物RQ3'3'5'5'第三節(jié)

RNA干擾技術反義技術

反義技術：根據(jù)堿基互補原理，用人工合成或生物合成的特定互補DNA或RNA片段（或其化學修飾產(chǎn)物）抑制或封閉基因表達的技術AntisenseNucleicAcid

反義核酸：根據(jù)堿基互補原則，用人工合成或生物合成的特定互補DNA或RNA片段（或其化學修飾產(chǎn)物）這類特異的核酸片段能夠與目的序列結合，通過空間位阻效應或誘導RNAase活性，在復制、轉錄、剪接、mRNA轉運及翻譯水平，抑制或封閉目的基因的表達。共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

2006年的諾貝爾生理學獎獲得者：AndrewZ.FireCraigC.MelloRNA干擾（RNAinterference，RNAi)一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內特定基因表達,促使mRNA降解,誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi,也譯作RNA干預或者干涉)。

TheappearanceofdsRNAtriggerstheRNAiresponse