毛細(xì)管電泳儀應(yīng)用於中藥成分之定量

毛細(xì)管電泳儀應(yīng)用於中藥成分之分析定量行政院衛(wèi)生署藥物食品檢驗(yàn)局顧祐瑞博士一前言中藥為我國(guó)重要的文化資產(chǎn)之一，原本就值得推廣與重視，近年來(lái)國(guó)內(nèi)許多大企業(yè)投入大筆經(jīng)費(fèi)，致力於中藥新藥之研發(fā)。由於中藥材之成分複雜，且常因基原、產(chǎn)地、採(cǎi)收季節(jié)、炮製、儲(chǔ)存等種種因素，致使其成分有相當(dāng)大的差異，進(jìn)而影響中藥材的品質(zhì)。因此，有關(guān)中藥成分之分析及品質(zhì)之管制，變得相當(dāng)?shù)闹匾?。行政院衛(wèi)生署為了提昇中藥濃縮製劑的品質(zhì)，已於八十九年七月二十四日公告，自九十年一月一日起，凡申請(qǐng)葛根湯等十種中藥方劑之濃縮製劑，查驗(yàn)登記新案及藥品許可證有效期間展延時(shí)，應(yīng)制訂指標(biāo)成分定量方法。美國(guó)藥物食品管理局(FDA)亦於八十九年八月公佈，「GuidanceforIndustry(Draft)BotanicalDrugProducts」(美國(guó)FDA植物性藥物產(chǎn)品規(guī)範(fàn)草案)，提出中草藥新藥研發(fā)，需以CMC(即化學(xué)、製造、品質(zhì))加以管制。目前中藥成分之分析定量，以高效液相層析(HPLC)最普遍，然而HPLC分析時(shí)存在著若干變數(shù)及困難，例如通常分析時(shí)間長(zhǎng)，且分析完成後管柱之清洗時(shí)間亦甚長(zhǎng)；更換溶媒、管柱，清洗管柱需要時(shí)間，致使儀器自動(dòng)化限制多；成分易殘留於管柱內(nèi)，清洗不易，使用之緩衝溶液等添加劑，則易損害管柱內(nèi)之填充物；管柱及溶劑費(fèi)用高，尤其會(huì)產(chǎn)生大量含有有毒溶劑(如乙月青、二氯甲烷)之廢液。毛細(xì)管電泳(Capillaryelectrophoresis或Highperformancecapillaryelectrophoresis)，簡(jiǎn)稱CE或HPCE，是最近十年來(lái)蓬勃發(fā)展的分析方法，電泳是電介質(zhì)中帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同速度向電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象，利用這種現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)成分進(jìn)行分析的技術(shù)。毛細(xì)管電泳的發(fā)展，在1967年Hjerten等率先提出在高電場(chǎng)，直徑3mm毛細(xì)管中作自由溶液的毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillaryzoneelectrophoresis)，簡(jiǎn)稱為CZE；1984年Terabe等建立一種重要的分離模式，即以各組成分(特別是中性成分)，在毛細(xì)管內(nèi)的膠束(Micelle)及緩衝溶液之間的分配為基礎(chǔ)之膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管層析(Micellarelectrokineticcapillarychromatography)，簡(jiǎn)稱為MECC或MEKC；1990年Honda等最早將毛細(xì)管電泳應(yīng)用於芍藥中Paeoniflorin及Oxypaeoniflorin之定量，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管電泳之再現(xiàn)性佳，定量結(jié)果與HPLC相似。毛細(xì)管電泳的種種方法中以上述CZE及MEKC最常用，其中CZE是毛細(xì)管電泳中最簡(jiǎn)單的一種方法，毛細(xì)管內(nèi)只充入緩衝溶液，分析之成分以不同的速率在分立的區(qū)帶內(nèi)進(jìn)行遷移，正、負(fù)離子化合物即可分離，而中性化合物在電場(chǎng)中則不會(huì)移動(dòng)。MEKC是毛細(xì)管電泳中應(yīng)用最廣的方法之一，既能分離中性成分，也能分離帶電成分，MEKC主要是在緩衝溶液中，加入一定濃度以上的界面活性劑，以形成膠束，其應(yīng)用範(fàn)圍包括維生素、大部分藥物及中藥成分。本文所舉之天麻及玄參兩個(gè)例子，皆為MEKC方法，且均以膽酸鈉作為界面活性劑，分析二種藥材中之不帶電荷高極性成分。毛細(xì)管電泳之分析方法，係利用不同樣品離子電荷泳動(dòng)速度的差異，配合毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)在外加高電場(chǎng)下所產(chǎn)生的電滲流，形成各種樣品離子在毛細(xì)管中淨(jìng)移動(dòng)速度不同，因而達(dá)到分離效果。與傳統(tǒng)的平板電泳或高效液相層析比較，毛細(xì)管電泳的分離效率極高，理論板數(shù)常在105~107左右。另外，毛細(xì)管口徑小，散熱效果佳，因此可使用高電場(chǎng)進(jìn)行電泳，大幅縮短樣品分離時(shí)間。毛細(xì)管電泳與高效液相層析皆屬液相分離技術(shù)，兩者之分離機(jī)制不同，各有其應(yīng)用的價(jià)值，惟就分離效率、分析速度、成本花費(fèi)及樣品用量而言，毛細(xì)管電泳之理論板數(shù)較高，分析速度更快，幾乎不消耗溶劑，而樣品用量?jī)H高效液相層析的數(shù)百分之一。毛細(xì)管電泳只要針對(duì)不同的分子性質(zhì)(如分子大小、電荷數(shù)、疏水性等)改變操作模式和緩衝溶液的成分，便可分離不同的樣品。相較之下毛細(xì)管電泳具有更大的選擇性，欲分析不同的樣品亦不需更換價(jià)格昂貴的管柱。毛細(xì)管電泳與高效液相層析之比較整理如下：碰毛細(xì)膀管電主泳室高效渴液相餓層析膏分析塔速度姑較快挖較慢史理論票板數(shù)仇較高據(jù)較低呈溶媒死消耗鋸無(wú)或慮少邊多望樣品纖量通低叔(趙以承nl韻計(jì)念)貧高轉(zhuǎn)(μ駁l崖計(jì)糠)庫(kù)管柱愚價(jià)格酬低錢高四管柱顫清洗洲快、鎮(zhèn)容易晉費(fèi)時(shí)罪自動(dòng)杜化思高團(tuán)不容獸易二?毛細(xì)管電泳應(yīng)用(一)麻藥材中Parishin、ParishinB及ParishinC之含量測(cè)定：天麻，原名赤箭，別名明天麻，係蘭科(Orchidaceae)植物天麻Gastrodiaelata的乾燥根莖。Parishin(tris[4-(β-D-glucopyranosyloxy)benzyl]citrate)、ParishinB及ParishinC(1,2-及1,3-bis[4-(β-D-glucopyranosyloxy)benzyl]citrate)為自天麻分離得到之三種高極性成分，分別為帶有三個(gè)及二個(gè)葡萄糖之檸檬酸鹽，筆者建立了三種成分之毛細(xì)管電泳與高效液相層析之分析方法，其條件如下：1.高效液相層析之條件：高效液相層析儀：Hitachi廠牌HPLCL-6200pump連接Hitachi廠牌L-3000Photodiodearray檢測(cè)器及Shimazu廠牌SIL-9A自動(dòng)注射器。分析柱：Cosmosil5C18-AR，5μm，內(nèi)徑4.6mmI.D.×150mm。檢測(cè)波長(zhǎng)：UV222nm。移動(dòng)相：A：甲醇。B：0.1%磷酸溶液。時(shí)間(分)AB線性梯度條件01585152575303070403070仿流速箱：1燒.0墾mL瘋/m民in將。撿內(nèi)部度標(biāo)準(zhǔn)膠品：虛Su怕lf條am拐et藝ho疾xy三py校ri羅da忽zi伙ne韻。叛2.除毛侄細(xì)管的電泳吊層析寨之條貍件：穩(wěn)荷毛細(xì)懷管電僻泳儀敏：B百ec糠km尤an重廠牌報(bào)P/皆AC網(wǎng)E挽55僻00慧。盲毛細(xì)拼管：癥Be雨ck殖ma桃n鬼內(nèi)徑鐵75催mm州×6慢7c璃m譽(yù)un跡co節(jié)at慢ed菠c鑄ap土il眠la擴(kuò)ry葡。栽檢測(cè)刷波長(zhǎng)呆：U猴V遺22創(chuàng)2n絮m。個(gè)醉緩衝捏液：勾20咬mM投S扶od瞞iu悲m中te寒tr海ab國(guó)or燥at蕉e及粉20檢mM碗S與od焰iu慘m邊di彼hy存dr澇og倦en鼻ph墾os鋼ph建at鉗e調(diào)仁配為首pH吳6.屑5含掙10暗0m校M墓So捕di側(cè)um說(shuō)c傅ho填la奮te沙之溶娃液。摔嬸溫度部：3峰0℃松。藏電壓鄉(xiāng)：1旗5K臘V。搶芳內(nèi)部愈標(biāo)準(zhǔn)翼品：耗Me憲th晶yl虛pa哄ra技be槳n。敲肺響天麻鬼三種兩成分冶之毛扎細(xì)管牧電泳梳分析逃，緩創(chuàng)衝液塵用歸pH飾6.牢5四復(fù)硼酸笨鈉及味磷酸碗二氫憑鈉，竿加入破膽酸鑒鈉作焰界面聰活性拔劑，遠(yuǎn)其圖述譜如杰圖一皺所示遮，可殼在十帽七分占鐘內(nèi)組完成監(jiān)，並吃且有報(bào)很好夕的回支收率涂(9衰4.贏8~摔10秀0.磨5%腥)及猴再現(xiàn)嚇性(回同日松內(nèi)之武相對(duì)膽標(biāo)準(zhǔn)血偏差彎為1磨.2繳3~臟2.臉80困%；純異日驗(yàn)間之寸相對(duì)掏標(biāo)準(zhǔn)該偏差妹為1考.7額2~搶3.玻24拳%)勾，高誼效液佩相層恨析分凡析時(shí)起間較攜長(zhǎng)，研如圖難二所素示，度為毛也細(xì)管刺電泳擔(dān)之二賢倍。遞比較鍬二種兇方法燭之再岡現(xiàn)性掌(如狀表一捷)，卷毛細(xì)尋管電粉泳無(wú)繞論在提三次償分析潤(rùn)成分相時(shí)間碼或含華量測(cè)適定之潤(rùn)相對(duì)誰(shuí)標(biāo)準(zhǔn)休偏差仗，其絡(luò)結(jié)果脆均在習(xí)2%屈以下與，與膀高效崖液相睬層析燭相當(dāng)曠。以守二種曲方法葬定量限分析絡(luò)四件眠市售夾天麻躍藥材杰，其洗結(jié)果胸相差埋不多如(盟如表毀二所掩示)段。浸表一伏天庫(kù)麻藥邁材中郊指標(biāo)幣成分弦分別車以高捉效液債相層鎖析及筐毛細(xì)匙管電命泳分灶離之岸再現(xiàn)掛性比誘較指標(biāo)成分

高效液相層析

毛細(xì)管電泳

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%,n=3)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%,n=3)

滯留時(shí)間含量測(cè)定遷移時(shí)間含量測(cè)定Parishin1.240.481.541.18ParishinB1.140.201.312.01ParishinC1.221.751.261.59噸(二體)玄蓬參中種2-慈(3墾-H螞yd吐ro撕xy嫁-4展-m炸et之ho叨xy鐮ph富en曠yl刃)肯et紙hy借l洽1-泄O疫-[胡α-鬼L-帽ar栽ab獸in病op箱yr妖an說(shuō)os秒yl住(循1→慰6)保]-排fe逝ru役lo由yl賢(1盈→4滅)-檔α-怎L-勒rh適am遍no塔py暴ra村no輛sy垮l(胖1→旦3)普-β覆-D莫-g圾lu漁co芬py靈ra砍no液si奶de敘(S聯(lián)N-罰A)掉、夕Ha餐rp檔ag亡os心id爪e(罰SN到-B拼)及電Ci籮nn環(huán)am慰ic熔a降ci勾d(家SN籍-C氣)之妨含量消測(cè)定狹：沿養(yǎng)玄參豈，別榮名元除參、冤黑參攪，係頓玄參紙科(沙Sc膛ro挖ph門ul虛ar肚ia桐ce霧ae資)植斯物玄哀參已Sc叢ro展ph刺ul漢ar顧ia閣n脫in鍵gp桌oe窯ns坑is村唐或匪S.求b勵(lì)ue捷rg叨er西ia無(wú)na她搶之乾第燥根膊。S您N-佳A、鮮SN耗-B酷及S班N-詞C為亮自玄傾參分茫離得鏡到之隱三種脅高極奪性成疼分，蛛其中喇SN晶-A炮為帶寸有阿意拉伯會(huì)膠糖貧、鼠狼李糖渴及葡侵萄糖奏之複滴雜化窮合物匠；S點(diǎn)N-本B線為帶貓有一堅(jiān)個(gè)葡極萄糖勢(shì)之化美合物繼；S芒N-屠C(臺(tái)桂皮閘酸)木為小如分子世化合粗物，糾三種木成分屈之分休子量談分別沈?yàn)?吊84害、4黎94唉及1告48付，其慮差異萍頗大斗，但戀因毛習(xí)細(xì)管蝦電泳壯之選痛擇性權(quán)高，帳仍可朗在短聲時(shí)間題內(nèi)完?duì)砍煞职??；孛?xì)姻管電樸泳與贏高效毀液相蜘層析務(wù)分析朽方法翻之條籮件如先下：播游1.內(nèi)高效潮液相冠層析社之條肺件：筐劍高效燈液相擴(kuò)層析父儀：速與天笑麻相散同。沾買層析掠管：吊Co安sm濤os仇il擺5霉C沃18汪-A輕R,利5m棚m,拿內(nèi)徑礙4.德6m浴m×等15墊0m昌m。寫表二驢四坐件市泳售天池麻藥堅(jiān)材分質(zhì)別以曾高效醫(yī)液相評(píng)層析紹及毛說(shuō)細(xì)管濫電泳匆定量蟻之結(jié)再果泰指標(biāo)鮮成分優(yōu)市售缸藥材符毛細(xì)貼管電處泳

砍(m滑g/垮g)散高效感液相哪層析

軍(m擋g/中g(shù))紐Pa冬ri糾sh抖in運(yùn)1潔12釋.5綿6蠅13狹.5足1壺2很14逃.5射5社15排.1宗5該3信6.司86輸6.眉99怨4斯6.弊45吸6.敞42懇Pa昨ri數(shù)sh除in捏B鑄1維4.勺83始4.所64歉2清4.全88截4.蝴53膀3毀3.摧31凝3.昨06壞4頸2.倘46刊2.意32狗Pa核ri郵sh誼in飲C禍

貫1陷2.慰17夢(mèng)2.囑25稱2障2.揮17倆2.集08獸3針1.岡38帳1.咐37牧4效1.憲25暈1.寨30燃檢測(cè)封波長(zhǎng)煤：U郊V艘27廊8n除m。錘移動(dòng)情相：堆A：占乙月什青鴨B：汗1.突0%結(jié)醋酸倆溶液資。時(shí)間(分)AB線性梯度條件01585442773勺流速端：1宮.0接mL跪/m處in芽。蛾內(nèi)部震標(biāo)準(zhǔn)昏品：鹽So爛rb討ic誓a輪ci跟d。佩縱2.晨毛細(xì)題管電遺泳層久析之導(dǎo)條件睛：橋毛細(xì)緣管電華泳儀料：與晶天麻薯相同友。魚毛細(xì)夠管：蛋Be貫ck腿ma始n情內(nèi)徑賣75辨mm碎×6侵7c清m孩un跑co折at馬ed掛c剃ap女il劣la索ry營(yíng)。讓表三晴玄揮參藥到材中矮指標(biāo)滿成分嘆分別鼠以高童效液膨相層勁析及梢毛細(xì)抬管電持泳分屢離之僻再現(xiàn)補(bǔ)性指標(biāo)成分

高效液相層析

毛細(xì)管電泳

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%,n=3)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%,n=3)

滯留時(shí)間含量測(cè)定遷移時(shí)間含量測(cè)定SN-A0.061.000.221.11SN-B0.011.720.282.80SN-C0.041.720.211.22系檢測(cè)矮波長(zhǎng)坑：U朵V怠28陸0n辛m。莊湖緩衝叼液：假20苦mM應(yīng)S暗od否iu甲m善te題tr盾ab郊o(jì)r觀at么e及抵20驢mM區(qū)S逃od投iu男m梁di民hy深dr避og數(shù)en瑞ph射os名ph關(guān)at印e調(diào)健配為彼pH書7.伐5含仰12稼0m清M圾So寄di鬧um陶c臭ho灘la券te刷及1更2%顏甲醇身之溶繞液。纏溫度劣：2烏5℃由。止電壓駕：2爆5k分V。面內(nèi)部榮標(biāo)準(zhǔn)互品：飲Pr截op堂yl減pa國(guó)ra僚be逢n。企酷能玄參肚三種盒成分萄之毛臨細(xì)管瘋電泳撫分析陷，緩天衝液樹用叨pH啦7.辦5四魄硼酸押鈉及擇磷酸尾二氫批鈉，暖加入蔽膽酸搬鈉作餐界面劉活性勞劑、遭甲醇葛作修戒飾劑撓，其口圖譜割如圖拌三所船示，眉可在夜十九義分鐘盛內(nèi)完赴成，慎也有漁很好巷的回寺收率樓(1巨02案.4稍~閥1忍03愁.5沙%)宮及再蝦現(xiàn)性鋼(同糊日內(nèi)如之相玩對(duì)標(biāo)黃準(zhǔn)偏劈差為后0斃.5抄5額~1蘋.7津1%方；異鞏日間塑之相蘆對(duì)標(biāo)知準(zhǔn)偏等差為圓1.督36葡~輔3窩.8邊3%眾)，請(qǐng)高效嗎液相夜層析饒分析鐮時(shí)間劉較長(zhǎng)裁，如語(yǔ)圖四解所示革，亦俯為毛葵細(xì)管維電泳蠻之二妨倍。紡比較排二種拼方法牢之再更現(xiàn)性止(如械表三筐)，壽毛細(xì)午管電尿泳在玉三次孔分析叨成分侍時(shí)間漆，其逗結(jié)果糖均在北0.亭3%凍以下蝦，含況量測(cè)賓定之傭相對(duì)素標(biāo)準(zhǔn)鹽偏差梁，其精結(jié)果匯均在返3.被0%跳以下讀，與踩高效回液相疾層析艱相當(dāng)甩。以噸二種產(chǎn)方法陜定量盟分析紫七件浮市售挎玄參述藥材對(duì)，其資結(jié)果肺亦相盒差不公多(參如表常四所燕示)岔。價(jià)三呆?烘結(jié)語(yǔ)東往毛細(xì)抗管電瞧泳具秘有高羽選擇舒性、初分析鉆時(shí)間帽短、桂管柱辱清洗微時(shí)間乘短、付再現(xiàn)熔性佳翠、可丈自動(dòng)襪化等膛特性器，適須合用市於大潔量品別管分冒析之賞用。賓由上鳳述所脂舉例返之二熔個(gè)研詞究觀疊之，須毛細(xì)劫管電驅(qū)泳可著用於蘇中藥直成分牌之分礙析，座其回屢收率杯及再另現(xiàn)性舍均不加亞於恩高效澆液相熱層析巡，運(yùn)乞用毛心細(xì)管峽電泳獲從事罷中藥炸成分能之分屬析確染屬可疾行?；瓯硭母蛊呒魇惺垩托㈣T藥材溫分別障以高押效液察相層品析及播毛細(xì)慢管電可泳定嬸量之熱結(jié)果指標(biāo)成分市售藥材毛細(xì)管電泳

(mg/g)HPLC

(mg/g)SN-A11.701.7922.092.0031.971.9141.121.0651.671.6360.700.6571.451.45SN-B10.450.4620.600.6031.461.4241.221.2251.441.4160.330.3470.670.70SN-C10.160.1620.320.3230.110.1140.280.2950.270.2760.070.0770.270.28市圖二盒天麻穩(wěn)之高胃效液第相層勾析分柔析圖充譜。盯1騙：步Pa服ri洽sh慰in爐B畏；孔2董：敢Pa懶ri宏sh吃in棟C瓣；末3轎：巡Pa廢ri參sh銜in綱。近IS幕：內(nèi)夏部標(biāo)寒準(zhǔn)品敢(S開ul厘fa旺me距th刃ox廉yp列yr委id淡az劫in祥e)握?qǐng)D一毛天間麻之湯毛細(xì)精管電統(tǒng)泳分今析圖毫譜。世1：哥Pa跟ri丟sh割in吵B咽；欄2：扎Pa削ri戶sh雹in虎C襖；炕3：撿Pa槽ri內(nèi)sh哭in贏。聚IS驚：內(nèi)價(jià)部標(biāo)右準(zhǔn)品瓶(M香et虛hy王lp復(fù)ar栽ab分en象)。蕩圖三恨玄參貝之毛客細(xì)管撿電泳屑分析杠圖譜供。徑IS右：內(nèi)貞部標(biāo)主準(zhǔn)品施(P耽ro別py歉lp卸ar花ab研en垃)嘉。嚴(yán)圖四閥玄參濟(jì)之高呆效液殊相層扁析分城析圖搜譜。購(gòu)IS究：內(nèi)綠部標(biāo)務(wù)準(zhǔn)品升(S翠or決bi捷c損ac導(dǎo)id牲)浩。攏參考談文獻(xiàn)吸1.朽Be懲al翻e隊(duì)SC欄.,掛1柜99椒8,紛C狠ap乞il蘋la帥ry接e裹le鉛ct距ro緞ph槍or隸es惱is紗.禍A鋤na浩lt余ic渣al兵C拖he保mi男st旁ry呼7腥0:答2鳴79基R-餃30鹿0R六.肅2.島Mc疏L患au鞭gh弟li矩n扭GM嚴(yán),聚No消la嘉n敗JA清,杠Li悄nd鑰ah園l件JL竿,湊Pa顛lm憶ie決ri冠R滔H,刺A楊nd弱er罵so辭n量KW鞭,昆Mo沉rr予is朱S描C,顆M顏or號(hào)ri促so壞n著JA率a湖nd慕B嚷ro疫nz表er伯t摘TJ捧.,紗1峽99唯2,柜P露ha兔rm摘ac別eu捉ti得ca城l浩dr忽ug渠s療ep粘ar慘at器io情ns伍b寒y黑HP折CE掉:狐Pr決ac端ti策ca烈l鍋gu店id嗽el渾in池es鹿.