臨床PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)習(xí)生講課演示文稿

臨床PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)習(xí)生講課演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了兩種核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復(fù)制模型。一、PCR概述當(dāng)前第2頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一種在體外通過(guò)重復(fù)DNA合成，以擴(kuò)增特定核苷酸序列的方法。特點(diǎn)高靈敏度高特異性體外進(jìn)行快捷當(dāng)前第3頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)PCR的概念核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴(kuò)增反應(yīng)不需要每一個(gè)循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，PCR技術(shù)成為了分子生物學(xué)中的一項(xiàng)突破性技術(shù)。當(dāng)前第4頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇當(dāng)前第5頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)一、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）（膜板與引物雜交）（DNA合成）不斷重復(fù)當(dāng)前第6頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）核酸提取1.DNA提取100ul濃縮液100ul血清吹打混勻12000g離心5min棄上清20ul提取液100℃煮10min模板當(dāng)前第7頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)步驟2.RNA提取10ulA液200ulB液震蕩混勻8000g離心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g離心1min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA棄上清重復(fù)洗2次50ul血清當(dāng)前第8頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)3、細(xì)胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震蕩混勻12000g離心5min完全棄上清加入試劑3模板加樣擴(kuò)增雜交顯色當(dāng)前第9頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（二）擴(kuò)增HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC

下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG擴(kuò)增體系：（50μl體系）

10*Buffer---5μldNTP---1μlMgCl2---3μlPrimerF---2μlPrimerR---2μlDNA

---2μlTaq酶---1μlH2O---34μl當(dāng)前第10頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)反應(yīng)程序預(yù)變性94C3min循環(huán)延伸72C5min。注：每組實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照用無(wú)菌生理鹽水代替模板58C45s72C45s94C45s30循環(huán)當(dāng)前第11頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（三）結(jié)果判讀當(dāng)前第12頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（四）PCR的常見(jiàn)問(wèn)題及處理措施常見(jiàn)問(wèn)題污染：表現(xiàn)為陰性對(duì)照同樣出現(xiàn)目的條帶或陰性對(duì)照出現(xiàn)‘S’形曲線。污染的來(lái)源：來(lái)自其他測(cè)試樣品的DNA來(lái)自試驗(yàn)材料如重組克隆的DNA外源DNA污染來(lái)自同一靶序列前一次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物。

當(dāng)前第13頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（三）PCR的常見(jiàn)問(wèn)題及處理措施如何減少污染實(shí)驗(yàn)室分區(qū)當(dāng)前第14頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR產(chǎn)物不能用UNG完全消除污染。紫外線表面照射消除試劑、加樣頭中的DNA污染。對(duì)短PCR產(chǎn)物效果不好以預(yù)防污染為主良好的實(shí)驗(yàn)室操作當(dāng)前第15頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)三、熒光定量PCR當(dāng)前第16頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（一）熒光PCR定量的概念

以外參已知數(shù)量拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)擴(kuò)增及對(duì)熒光值的監(jiān)測(cè)，對(duì)PCR起始模板量的定量。當(dāng)前第17頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（二）熒光定量PCR原理染料染色SYBR?GreenI溴乙錠(EthidiumBromide)探針標(biāo)記TaqManTM

分子信標(biāo)(Molecularbeacons)當(dāng)前第18頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'當(dāng)前第19頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（三）定量PCR的數(shù)學(xué)原理PCR理論方程N(yùn)=N0x(1+E)nN: 擴(kuò)增數(shù)量N0: 起始模板數(shù)量E： 擴(kuò)增效率n: 循環(huán)數(shù)當(dāng)前第20頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)指數(shù)期PCR定量方程才有效Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長(zhǎng)期Linear平臺(tái)期Plateauy=x(1+e)n指數(shù)增長(zhǎng)期Geometric當(dāng)前第21頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)PCR曲線線性圖譜半對(duì)數(shù)圖譜當(dāng)前第22頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量終點(diǎn)定量“加進(jìn)不同拷貝的膜板”半對(duì)數(shù)圖譜線性圖譜當(dāng)前第23頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)同一個(gè)樣品重復(fù)96次起點(diǎn)定量的優(yōu)勢(shì)終點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：誤差太大拐點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小當(dāng)前第24頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)起點(diǎn)定量的關(guān)鍵：CT值CT值：熒光信號(hào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著增長(zhǎng)(穿過(guò)閾值線)時(shí)的循環(huán)次數(shù)CT值半對(duì)數(shù)圖譜CT值線性圖譜當(dāng)前第25頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)CT起始DNA濃度當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT值時(shí)：RT=RB+X0(1+E)CT

Rs

lg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即

CT=-klgX0+b（線性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRs當(dāng)前第26頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)CT值-X0作圖CTX0CT=-klogX0+b當(dāng)前第27頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)四、PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用

（一）標(biāo)本采集要求當(dāng)前第28頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)項(xiàng)目標(biāo)本采集HBV無(wú)菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無(wú)菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標(biāo)本。2.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標(biāo)本或咽拭子。也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無(wú)菌加蓋試管。2.其他組織標(biāo)本：留于無(wú)菌試管。。3.也可取抗凝血標(biāo)本,但需分離單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)，陽(yáng)性率才會(huì)高。（于發(fā)熱時(shí)抽取）MP

咽拭子當(dāng)前第29頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)項(xiàng)目標(biāo)本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細(xì)小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應(yīng)略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無(wú)菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無(wú)菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動(dòng)棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無(wú)菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV當(dāng)前第30頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)（二）結(jié)果分析、報(bào)告及解釋1.定性PCR與定量PCR的比較2.定量PCR測(cè)定的臨床意義3.定性PCR測(cè)定的臨床意義4.定性和定量測(cè)定的結(jié)果報(bào)告及解釋當(dāng)前第31頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)1.定性PCR與定量PCR的比較當(dāng)前第32頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳當(dāng)前第33頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)定量PCR擴(kuò)增曲線圖當(dāng)前第34頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)2.定量PCR的臨床意義對(duì)致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測(cè)彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）對(duì)治療過(guò)程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測(cè)用于基因表達(dá)方面的研究當(dāng)前第35頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)某患者HBV-DNA的PCR結(jié)果動(dòng)態(tài)圖日期HBV-DNA2004-6-39.3E+72004-12-72.0E+62005-4-191.8E+32005-7-250.0E+0當(dāng)前第36頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)3、定性測(cè)定的臨床應(yīng)用診斷用于篩檢耐藥突變檢測(cè)病毒基因型檢測(cè)GGAGGGAGAAAA當(dāng)前第37頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期二\17點(diǎn)4.定性和定量測(cè)定的結(jié)果報(bào)告及解釋?zhuān)?）定性陰性陽(yáng)性（2）定量(以我