過程中常見問題及處理方法演示文稿

過程中常見問題及處理方法演示文稿當前第1頁\共有36頁\編于星期一\15點過程中常見問題及處理方法當前第2頁\共有36頁\編于星期一\15點WB的簡介WB即蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。

當前第3頁\共有36頁\編于星期一\15點

基本原理通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。當前第4頁\共有36頁\編于星期一\15點

應(yīng)用1.目的蛋白的表達特性分析2.目的蛋白與其它蛋白的互作3.目的蛋白的組織定位4.目的蛋白的表達量分析當前第5頁\共有36頁\編于星期一\15點當前第6頁\共有36頁\編于星期一\15點當前第7頁\共有36頁\編于星期一\15點當前第8頁\共有36頁\編于星期一\15點三、WB的影響因素步驟較多，任何一步都可能影響結(jié)果1、電泳分離蛋白蛋白抽提；蛋白定量；樣品制備變性；上樣量；電泳（電壓、電流的大小，膠濃度、制膠）當前第9頁\共有36頁\編于星期一\15點2、轉(zhuǎn)膜膜的選擇；膜的確認；特殊處理；……當前第10頁\共有36頁\編于星期一\15點3、封閉封閉液的選擇；封閉條件優(yōu)化；……當前第11頁\共有36頁\編于星期一\15點4、漂洗漂洗液的配制與選擇漂洗時間及次數(shù)當前第12頁\共有36頁\編于星期一\15點5、抗體孵育抗體及稀釋液選擇；抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化；抗體孵育時間；……當前第13頁\共有36頁\編于星期一\15點6、曝光曝光時間的掌控當前第14頁\共有36頁\編于星期一\15點四、注意事項1.蛋白樣品的提取盡可能新鮮組織或蛋白避免反復(fù)凍融對于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）

選擇合適的裂解液準確定量（BSA標準蛋白）

當前第15頁\共有36頁\編于星期一\15點當前第16頁\共有36頁\編于星期一\15點2、制膠根據(jù)不同的蛋白大小，選擇不同的濃度制膠。當前第17頁\共有36頁\編于星期一\15點

制膠的時候一定要注意玻璃板一定要干凈，不能有殘留的膠。玻璃板底部放平，盡量不能漏膠灌膠的時候，不能太快，容易產(chǎn)生旋窩水或異丙醇壓的時候，不能太久當前第18頁\共有36頁\編于星期一\15點

3、轉(zhuǎn)膜a泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液浸泡20min；

凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化當前第19頁\共有36頁\編于星期一\15點c膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板，不能放反d轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻e具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短f避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。當前第20頁\共有36頁\編于星期一\15點g夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉(zhuǎn)膜不完全h保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率i一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景當前第21頁\共有36頁\編于星期一\15點4、封閉

a脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素

b如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化c檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑當前第22頁\共有36頁\編于星期一\15點5、孵育a洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效價問題當前第23頁\共有36頁\編于星期一\15點五、常見問題及解決電泳中的問題︶條帶呈笑臉狀——凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;——電泳系統(tǒng)溫度偏高當前第24頁\共有36頁\編于星期一\15點︵條帶呈皺眉狀

可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全當前第25頁\共有36頁\編于星期一\15點

拖尾樣品溶解不好當前第26頁\共有36頁\編于星期一\15點紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒當前第27頁\共有36頁\編于星期一\15點條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜當前第28頁\共有36頁\編于星期一\15點條帶兩邊擴散加樣量過多當前第29頁\共有36頁\編于星期一\15點

Westernblot結(jié)果曝光問題

背景過高且不均勻1、封閉不充分——延長封閉時間；——更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）

2、一抗?jié)舛冗^高——增加一抗稀釋倍數(shù)；

3、抗體孵育溫度過高——4℃孵育當前第30頁\共有36頁\編于星期一\15點4、二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)——設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?、洗膜不充分——增加洗滌次數(shù)，增加洗膜次數(shù)當前第31頁\共有36頁\編于星期一\15點沒有陽性條帶或很弱1、一抗、二抗等不匹配訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物?？赏ㄟ^設(shè)置內(nèi)參可以驗證二級測系統(tǒng)的有效性更換更好的一抗二抗當前第32頁\共有36頁\編于星期一\15點2、一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度；長孵育時間；當前第33頁\共有36頁\編于星期一\15點3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠）當前第34頁\共有36頁\編于星期一\15點4、樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至少